黑色素形成的生物化学机制综述

有史以来黑色素沉着就引起了人们的好奇与关注。 这种兴趣部分源于人类社会对皮肤保护和色素沉着的美容意义。另外，更重要的原因是黑色素的生成在黑素瘤 的形成过程中可能扮演的角色，即黑素瘤被认为是最危险的恶性肿瘤。如Ewing所阐述“色素的变化为细胞的功能活动提供了非常微妙的指示，也为追踪功能活动与肿瘤细胞的生长能力之间的关系提供了独特的机会”。因 此，黑色素的形成机制吸引了各个领域的关注。例如， 细胞学对于黑色素颗粒的研究；遗传学、人类学和生物学对于遗传、环境和营养与色素形成的关系的研究；有 机化学和生物化学对于黑色素形成的化学机理的研究。

在过去的20多年里关于黑色素的形成发展形成了几个综合性的观点，但在这些观点中，只有少数涉及到生物化学方面。并且在不同物种中，黑色素的形成过程并没有联系起来。关于人类、低等动物和植物的黑色素形成都提了不同的机制。

通过对植物、昆虫和海洋动物黑色素形成的生物化学研究表明：L-酪氨酸被酪氨酸酶催化氧化形成二羟苯 基L-丙氨酸(多巴)然后多巴被氧化生成黑色素。

然而，直到最近，哺乳动物组织中酪氨酸酶的存在还没有得到确切的证实。人们认为哺乳动物组织中黑色素的形成机制与其他物种不同。组织化学证据表明哺乳 动物的皮肤含有一种酶，多巴氧化酶，它能催化多巴而不是酪氨酸氧化生成黑色素。

很大程度上基于这些理念，形成了两个独立的黑色素进化假说。即昆虫和植物中黑色素的形成与酪氨酸酶 相关，哺乳动物黑色素的形成与多巴氧化酶相关。

在本综述中，根据最近的证据表明，这些单独的概念现在可以合并成一种假设，以解释人类、低等动物、 昆虫和植物中黑色素的形成机制，主要考虑与黑色素形 成有关的酶的性质及其反应机制。在可能的情况下，我 们将尝试将这些特性和反应机制与正常的及病理的黑色素沉积联系起来。考虑到自然界中黑色素的广泛存在， 以及人们对黑色素形成问题的浓厚兴趣，在澄清黑色素形成的机制方面拖延如此之久，可能显得有些令人惊讶。这是因为在对黑素原生成的研究过程中遇到了一些障碍。首先，不知道黑色素（一种由邻二羟基苯基化合物，如多巴、肾上腺素、儿茶酚氧化而成的深色聚合产 物)的化学成分；其次，黑色素很难纯化，因此不同的研 究人员报告了不同的化学成分；再次，不能制备出对酪氨酸和多巴具有酶活性的表皮提取物，这可能是由于皮肤中酶的含量很少，也可能是由于研磨和均质皮肤提取液的效果不理想；最后，黑色素从其前体形成是一个复杂的过程，涉及几个步骤，反应的速率取决于周围的许 多化学和物理因素。

组织学研究

早在1901年，Furth就提出了黑色素形成假设，即 黑色素是细胞内氧化酶作用于某些蛋白质分子中的芳香或色素群的结果。一位瑞士皮肤科医生Bloch在这个假设的激发下，试图用实验方法来证明它。他的实验方法是基于两个临床观察。首先，黑色素沉着是Addison病的 一个典型特征，这是一种由于肾上腺功能不全引起的疾病。在色素沉着增加和类肾上腺素物质代谢异常之间可能存在某种联系，尽管这种联系是矛盾的。其次，在转移性黑色素瘤的病例中，其尿液中含有大量的儿茶酚衍 生物。这些结果表明，黑色素前体与肾上腺素和儿茶酚化合物之间存在化学相似性。因此，Bloch选择了一种天然存在的氨基酸，3,4-二羟苯-L-丙氨酸(他将其缩写为 dopa，使用其德语名的首字母，di-oxy-苯丙氨酸)作为组织化学研究的对象。

Bloch把冰冻的人体皮肤色素沉着部分浸入1：1000 的多巴溶液中（加入缓冲液至pH7.3-7.4）。他发现在室温下24小时后黑色素颗粒被分解在位于表皮的基底层细胞 的细胞间。Bloch把这些特殊的细胞叫黑素母细胞，它位 于表皮-真皮交界处，是产生黑色素的地方。此外，这种 反应的强度与皮肤形成黑色素的能力是一致的。黑色素沉积在皮肤色素沉着的区域是最剧烈的，如表皮的基底层， 毛基质的生发层和毛基质细胞以及色素痣细胞。白化病患 者和白癜风患者的皮肤不会出现黑色素沉积，白化病是 一种局部的黑色素完全丧失的皮肤病。因此，Bloch认为 “多巴反应”是细胞形成色素能力的可靠指标。

黑素原的起源多年来一直是一个有争议的话题。 Bloch, Peck和一些人支持这样一种观点，即黑素原是由普通栅栏状基底细胞在特定刺激下产生的。Masson和 Becker则认为黑素原是神经上皮细胞的起源。近年来， 一些研究小组对两栖类、鸟类和小鼠进行了胚胎学研究，并最终认为黑素细胞来自神经嵴区域。

进一步的研究证据表明，特定细胞中多巴氧化生成黑色素的反应是由于一种叫做多巴氧化酶的存在。这一结论的证据包括:1）组织加热到100℃后不发生这种 反应；2）反应需在合适的pH条件下进行，最适pH为 7.32；3）当加入M/2000硫化氢或者M/500氰化钾（这两种物质为酶抑制剂）时反应完全终止；4）只有左旋多巴被细胞催化氧化。

为了进一步证实酶假说，Bloch和Schaaf从新生兔子的皮肤中取样，并通过直观量热法证明存在一种热不稳定的、氰化物敏感的催化剂，这种催化剂能够加速多巴形成 黑色素。在相同条件下，从白化病人皮肤的取样没有多巴的催化氧化反应。尽管Bloch测定酶活性的技术不详细， 但他的研究数据提供了令人信服的证据，证明某些表皮细 胞对多巴氧化的催化作用是由于一种酶的存在。

多巴氧化酶在正常人类或者动物皮肤中的存在并没有通过酶技术（通过测压法测量在多巴存在下皮肤薄片或提取物的摄氧量）得到证实。虽然有几位研究者尝试过用这种方法验证，但都没获得成功，这可能是因为皮肤中的酶含量太少，而且很难制备出适合测定酶活性的皮肤提取物和匀浆。还有一种可能是，在制备皮肤提取物时，研究人员忽略了考虑到自然产生抑制剂的可能 性—这种抑制剂可以掩盖酶的存在。最近，Rothman 和他的同事们成功地解释了在人类表皮中存在一种水溶 性、可透析的、热稳定的植物酪氨酸酶抑制剂。这种抑制作用被碘乙酰胺和另一种强效的巯基抑制剂（对氯汞 苯甲酸）抵消了。后来的研究表明，巯基对表皮提取物 的抑制作用具有剂量依赖性。

虽然Bloch对多巴的组织化学研究已经得到充分证实，但是由于在哺乳动物组织中多巴形成黑色素的机理从未被证实，因此这种观点没有被普遍接受。Raper从粉虱的酪氨酸-酪氨酸酶反应中分离出结晶形式的多巴（作为反应的第一个氧化产物）。这有力地说明了黑色素的形成反应无论初始底物是酪氨酸还是多巴，在多巴 产生之后都是相同的，并且强调了在各种组织中酪氨酸转化为多巴的机制，存在一定的认知差距。Raper有力地证明了酪氨酸是一种天然存在的氨基酸，它存在于所有的皮肤组织中，也是植物和昆虫形成黑色素的原始物 质。正如之前所阐明的，在相同条件下（多巴是有效 的）培养冷冻皮肤切片与酪氨酸，不能观察到Bloch的多 巴 - 氧化酶反应。由于人们普遍认为酪氨酸是哺乳动物 组织以及植物和昆虫组织中酶促反应生成黑色素的天然 或生理基质，但是由于在哺乳动物细胞中酪氨酸转变为多巴的机制并不清楚，因此黑色素的形成机制多年来一 直是一个令人费解的问题。

对于黑色素的形成机制仍然有很多问题需要研究。 Bloch的定性研究可能可以通过使用当今的痕量化学分析方法来定量分析和组织学定位少量的酶。此外，通过使用C14标定法标定酪氨酸，可能能够说明其是否为黑色素细胞生成黑色素的原始物质。

生物化学研究

低等动物中黑色素的形成—酪氨酸酶的概念

在对植物和真菌的研究中，首次令人满意地观察到 了产生黑色素的反应的酶促性质。1895年，Bourquelot 和Bertrand报道在黑红菇中存在一种物质会转化生成黑 色素。这种物质后来被称作酪氨酸，它在真菌中被酪氨 酸酶催化并反应。此后，在各种植物和动物组织中都发现了酪氨酸酶的存在，并且有大量文章报道酪氨酸酶。

Raper通过使用从植物和粉虱中取得的酪氨酸酶证明了酪氨酸转化生成黑色素的反应机理。他研究表明在酪氨酸和氧存在条件下，酪氨酸先被氧化成多巴，然后多巴被氧化成多巴醌。多巴醌转化生成吲哚衍生物，其再在几步反应之后形成黑色素。图一，说明了这个化学反应过程中的细节。

这里介绍一些关于哺乳动物组织存在酪氨酸酶的早期报道。1903年，Gessard发现从马的黑素瘤中提取的物质能催化酪氨酸生产黑色素。DeCoulon在1920同样证实了这一发现。1907年，Alsberg从人的黑素瘤中提取的一种物质，可 以催化儿茶酚和酪氨酸形成黑色素。在随后几年，Neuberg 研究表明，从人体黑色素瘤中提取的物质可以加速酪氨和肾上腺素形成黑色素，而对于酪氨酸却没有效果。1919年， Winternitz报道，在猪的葡萄膜和马的皮肤组织中存在一种酶能催化酪氨酸变黑。

哺乳动物中黑色素的形成 —多巴氧化酶的概念

尽管之前人们普遍认为哺乳动物组织中存在酪氨酸酶，并且实验也证实了这一点，但是对于以下这些组织中是否存在酪 氨酸酶人们还是存在质疑。例如，Durham在兔子胎儿的皮肤中没有发现酪氨酸酶的存在。此外，没人能够证明正常色素性哺乳动物组织中酪氨酸酶的活性。最重要的是之前Bloch证实 在哺乳动物的皮肤中存在一种酶能够催化氧化多巴而不是酪氨酸形成黑色素。基于这些研究，人们认为在哺乳动物组织中存在多巴氧化酶而不是酪氨酸酶。虽然Bloch的观点并非没有遇到挑战，但它仍是目前为止最被接受的一种观点。

Hogeboom 和Adams在1942年，Greenstein和他的同事们在1944年，Lerner、Fitzpatrick、Calkins和Summerson 在1949年共同得出这样的结论：老鼠、人类和马的黑素瘤提取物中均存在酪氨酸酶和多巴氧化酶的活性物，这些活性物与在植物和低等动物的提取物中发现的类似。Calkins发现 正常的牛纤毛提取物中含有酪氨酸酶和多巴氧化酶。这些实验研究表明哺乳动物组织中存在酪氨酸酶，因此Bloch关于色素沉着是由于多巴氧化酶的假设学说需要被完善。

酪氨酸转变为黑色素的化学反应

图一显示了酪氨酸催化反应生成黑色素的过程。在酪氨酸和氧分子存在的条件下，酪氨酸被氧化生产多巴。通常此反应开始时很慢，但在诱导期后变得很快。酪氨酸转变成多巴是不可逆反应。多巴经过酶促反应生成多巴醌，此反应为可逆反应。后续反应在酶存在与否的条件下都能迅速进行，只是酶存在时反应会更快。多巴醌会快速地自发进行不可逆的分子内结构重排，即侧链的氮随着5,6-二羟基二羟 基吲哚-2-羧酸（亮氨酸化合物）的形成而附着于苯环的位置。这种亮氨酸化合物很容易发生可逆反应生成醌（多巴色 素）。多巴色素是一种红色的物质，他是黑色素生产反应中的第一种可见物。在生理条件下多巴色素脱去羧基进行结构重排生成5，6-二羟基吲哚，吲哚迅速被氧化成紫色的醌， 醌消耗一个氧原子后聚合生成黑色素。目前关于这个聚合反应的机理说明尚少。若多巴色素的分子内重排被亚硫酸加速，则不会发生脱羧反应并且不会形成5,6-二羟基吲哚-2- 羧酸（很容易被氧化成黑色素）。图一中所示的一系列反应，虚线箭头可能表示的是另一种反应机理。通过Raper与 其同事的出色工作（他们使用马铃薯和粉虱的酪氨酸酶）， 我们对酪氨酸酶促氧化过程中发生的化学反应有了很多了解。他们证明了以下三种物质是在酪氨酸中形成的，当酶作 用于多巴时形成物质Ⅱ和物质Ⅲ。这表明多巴可能是酪氨酸被氧化后生产的第一个化合物。

酪氨酸氧化形成多巴，多巴氧化形成多巴醌 —下面的事实证明这个推断是合理的。1）邻二羟基苯基化合物容易氧化成相应的正醌；2）与正醌反应的物质能够抑制多巴-酪氨酸酶反应中黑色素的形成；3）植物的酪氨酸酶已经被证实能催化氧化儿茶酚形成正醌，多巴被氧化形成多巴醌的反应也可能出现类似的情况。

Raper的研究也表明多巴色素（红色物质）形成于多巴的氧化反应。多巴色素能转化为5,6-二羟基二氢吲哚-2-羧酸(亮氨酸化合物)，此反应为可逆反应。由此看来，多巴喹 酮可能经历了分子内的变化，即侧链的氮经过重排附着在苯环的6位上，最终形成亮氨酸化合物。

因为亮氨酸化合物转化生成多巴，多巴可能生成吲哚化合物Ⅱ和化合物Ⅲ，因此人们认为多巴色素是亮氨酸化合物中一种简单的醌，其结构式如下，并且Mason通过分光光度分析证实了这一观点。

在酶催化氧化酪氨酸反应的正常条件下，多巴色素通过脱羧和重排反应转化为5,6-二羟吲哚。分光光度数据表明5,6-二羟吲哚迅速被氧化生成对应的醌，醌再被氧化生产黑色素。

需要指出的是图一仅仅展示了酪氨酸转化成黑色素的整体过程。事实上这个反应过程中可能出现更多的反应。例如醌中间体的形成，醌中间体可能被氧化生产醌或者重排生成 图示中的物质。未完待续

 

德之馨(上海)有限公司 马媛 梅鹤祥