利用平台分析方法来实施生物制药领域的QbD理念

目前，生物制药市场上以单克隆抗体（mAb）为基础的疗法是分子的主导类别。基于mAb的获批疗法数量持续同比增长并在2017年以八项获批疗法创下了纪录。

大量文献表明，mAb由大量变体组成，这些变体是这类治疗用药物的固有特性。变体可通过制造过程中的翻译后修饰（PTM）以及纯化、配制和储存过程中的物理或化学修饰而产生。许多这些变异形式已确定对药物安全性或功效有影响并被称为关键质量属性（CQA）。 CQA在整个开发、制造和批量测试过程中都受到监控。虽然每种mAb疗法在靶向和活性上都很独特，但mAb的理化性质通常只能在相对狭窄的范围内进行描述。

以质量源于设计（QbD）理念为重心并以病人安全为驱动，FDA和EMA等监管机构针对单克隆抗体的关键质量属性的解读和监控都制定了严格的规章制度。生物制药QbD尚未真正加以利用的一个关键领域是CQA测定平台策略的应用。本文将探讨高效液相色谱法（HPLC）在单克隆抗体的关键质量属性测定和监测中的重要性、实施完善的单克隆抗体HPLC平台方法的优势及其潜在范围和应用。

用于CQA测定的HPLC方法

人类利用的药品注册技术要求国际协调会议（ICH）将CQA定义为“物理、化学、生物或微生物特性或应使其保持在合适的限度、范围或分布以内来确保预期产品质量的特性”。

为了满足监测CQA和充分表征生物治疗分子的需求，目前有一些分析方法可加以利用。HPLC方法是表征许多关键CQA的最实用有效的方法，并且常用于电荷变体、肽图和聚合物分析等。如今，药物制造商面临的挑战是为单个mAb或mAb变体开发和优化必要的CQA方法以用于表征和过程（过程分析技术/批量测试）监测所耗费的时间。利用目前所有mAb疗法相似的理化特性，围绕相关标准构建平台方法，再通过硬件、耗材/试剂、软件和基础方法的标准化，药物制造商将受益匪浅：

缩短上市时间（开发速度更快）。

提高每个新生物实体（NBE）的成本可预测性。

提高标准化操作和员工培训的能力。

减少对当前操作的干扰。

减少浪费。

提高在商业应用或外包之前设置和测试完整分析平台的灵活性。

与FDA对QbD、HPLC和质谱法的推动一致，仪器供应商正在与行业合作伙伴合作开发适用于CQA主要工作流程的平台方法。

以电荷变体分析为基础

虽然利用盐梯度洗脱进行电荷变体分析（CVA）的方法被广泛使用，但却从未被认为是可用于任何mAb产品的平台方法。蛋白质的不同等电点要求对每个mAb进行精心的长时间方法优化。针对CVA引入的pH梯度洗脱改变了这种观念，并使单一方法可用作所有mAb产品的全球启动方法。pH梯度可设定成覆盖一定的pH范围，目标mAb及其相关带电变体将在某一个点上达到其等电点，变成不带电并且从色谱柱上洗脱下来。该技术本质上是等电聚焦的一种，也是一种强大的变体浓缩技术。个别mAb的进一步优化可轻松地从初始筛选梯度开始。这些特征已将CVA稳稳地纳入了具有潜在平台适用性的常规方法列表中。随着商用缓冲液混合物的出现，这个目标已于近期得到了进一步发展，因为缓冲液混合物可对pH梯度进行出色的线性控制。

简化流程

肽图分析是适用于所有蛋白质疗法的工作流程，它可用于测量完整表征所需的多种CQA。一旦通过质谱法测得峰值，这种分析法就可以在HPLC—紫外（UV）方法中实施。质谱法是质量控制实验室的首选方法。

将高分辨率LC-MS肽图分析法转移到QC或生产环境中并非易事。蛋白质消化本身是样品制备的关键步骤之一并可能成为许多变化的来源。消化方案包含许多独立的步骤，而且其中几种试剂必须每天新鲜制备。因此，它成为了许多潜在错误的来源，并且对熟练技术人员的要求也让整个流程更耗时。基于磁珠的自动化和热稳定固定化酶方面的最新进展，正在解决部分问题。加热可使靶蛋白质变性，而且热稳定蛋白酶使消化能够在变性条件下发生。因此，消化所需的步骤可以减少为将靶蛋白质简单稀释到含有固定化蛋白酶的小瓶中、加热变性和消化。现代超高效液相色谱（UHPLC）系统和用于肽图分析的色谱柱变得越来越强大和稳定，进一步提升了可靠性和易用性。现代UHPLC系统具有保留时间（RT）精度，这对于正确识别靶蛋白释放的肽至关重要。

最近，多属性方法（MAM）引起了生物制药领域的诸多兴趣，其中在肽图分析法中加入高分辨率准确质量（HRAM）质谱信息被用于从单次注射中获得更多信息。使用这种方法进行临床试验的申请现已递交到FDA（美国食品药物管理局）处。

含Stamina的聚合物

随着肽图等单次注射MAM的出现，QC实验室在生产和批量测试期间不再需要多种方法。但是，很难用这种方法去评估的一种CQA——这种对患者安全有重大影响的CQA是药物产品的聚合物情况。治疗性蛋白质聚合物是因蛋白质结构的部分展开和/或构象异常变化而产生的降解产物，它暴露了亲水基团并促进了蛋白质—蛋白质非共价键的形成而产生二聚体、三聚体和更高级的结构。这种降解可能是因整个制造过程中众多阶段的次优条件所致，因此在每个阶段进行优化至关重要，包括：克隆选择、上下游加工、配方以及运输和储存，从而确保尽可能降低成品药品的聚合物水平。较高的聚合物水平有望通过降低产品的有效浓度来降低产品效率。过高的聚合物水平被发现可能会引发某些患者的免疫源应答。因此，这是一种在每次批量测试过程中都必须进行监控并上报来满足监管要求的CQA之一。

出于监管要求，制药公司必须进行数千次聚合物剖析评估。该评估的行业标准是使用缓冲盐洗脱液和HPLC的尺寸排阻色谱法（SEC）。该技术通过体积或更具体地说流体动力学半径将聚合物和聚合物碎片从单体药品中分离出来。这种分离因为大小不同的分子的微分扩散系数而成为可能。出于这一原因，具有指定孔径的色谱柱仅能够分离一定范围内与分子量有关的分子大小。幸运的是，mAb的分子量一直是约150kDa，因此针对这些治疗性蛋白质使用的是约300Å的孔径，从而使较小的物质能够扩散到孔中（例如：碎片、单体）而聚合物种类则大多被阻止在外，并且相对于单体和碎片种类更早地从色谱柱上洗脱下来。即使考虑到药品之间的巨大异质性，这种SEC方法也是一种全球适用的评估mAb的平台方法，因为mAb的分子量基本相同。这也意味着无需浪费时间为每种不同的药物开发并定制方法。该方法同时还是等效的，因此每次注射之间不需要等待色谱柱重新达到平衡。

平台分析方法的未来

实施完善的mAb HPLC平台分析方法可用于满足监测各种CQA的需求，这些已在上文做出了描述。CQA表征仪器和技术方面的最新进展显著提高了HPLC平台方法的适用性，例如：CVA和肽图分析。

可无缝集成易用型HRAM质谱法的平台灵活性还提供了其他优势，它能够生成单次注射的多个CQA信息。

尽管它能够集成平台方法来同时处理多个CQA，但一些CQA仍需经过专门分析。聚合物特性评估等实例具有非常高的生产量需求，因此这需要非常强大的平台方法，目前这一目标已经实现。