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化妆品包装微生物污染防护效果评价方法的开发

来源:轻大美妆 发布时间:2022-07-29 2002
食品饮料及个护食品与饮料食品及饮料配料食品加工及设备饮料加工及设备包装设备及材料其他个人护理品原料配料加工生产设备包装设备及材料其他包装包装设备包装印刷其他二次包装与物流标识与打码 包装
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Cite:Catovic et al. AMB Expr (2020) 10:81


摘  要


防腐剂的潜在危害改变了消费者的需求,他们越来越追求低防腐甚至无防腐的化妆品。因此,包装成为了防止产品免受微生物污染的重点。这就促使一系列多样化包装名词的出现,比如“防护”、“过度防护”和“屏障”等。然而,这些名称并不规范。为化妆品选择其适宜的包装基本上仍然是依靠经验的,也具有危险性,并且耗费时间。为此,美容谷专门成立了一个委员会,旨在确定能够对化妆品包装在防护微生物污染水平进行分类的一种系统且具有实操性的方法。如本文所述,这需要开发一种能够使用七天的特定抑菌培养基,并且需要开发一种能够重现产品使用过程中的污染以及消费者行为的体外方法。基于对800多份不同产地和性能产品包装的测试结果,我们将包装对于微生物污染的防护效果分为了六个等级。这项工作可视为朝着法规迈出的第一步。


关键词:化妆品包装;微生物污染;质量;评价

要点:评估化妆品包装的适宜性,旨在防止产品免受微生物的污染。



引 言 


个人护理产品和化妆品中防腐剂存在的健康和环境风险促使了低防腐甚至无防腐剂产品的出现。因为这类产品对微生物污染特别敏感,因此包装就成为了重要的保护手段。包装在这类产品中的重要性众所周知,而且在法规方面,包装也被视为最终产品的一个十分重要部分,并制定了EC 1223/2009产品保护性法规。包装主要有两个功能:通过限制所有潜在的反向污染保证内容物的安全;确保产品在整个货架期内的最小污染和安全用量。这些目标一定程度上是互相矛盾的,因为很难在整个产品生命周期中将增加的密封性和内容物的日常使用联系起来。一次性包装的产品是例外的,但是也会面临别的问题,例如容器和内容物之间的相互作用增加以及生态相容性问题等。另外,每次的使用也意味为包装内剩余部分和/或与倒出部分的潜在接触,当产品缺乏自身保护时,就会存在很高的污染风险。


既然包装是低防腐和无防腐产品的固有组成部分,使其性能匹配产品的保护需求是非常重要的。相反,某些活性物也具有一定的抑菌活性,因此即使在没有添加防腐剂的情况下,这样的配方也具有一定的抗微生物污染的能力,因此此处的包装也应该与之相适应,以避免产生过多的成本。已有文献报道了评价化妆品包装对微生物防护的评价方法,但由于包材和配方产品通常是由不同的厂家提供的,而且在缺乏法规和技术工具的情况下,想明确低保护到过度保护以及屏障性保护之间的区别,从而选择合适的包装层次,只能主要依靠经验,而这样的做法通常是有害的。


作为全球领先的香水和化妆品资源中心的美容谷,具有联合包装界和化妆品行业的专家的天然优势,使得首次定义一个适合行业所有人员的功能合适的技术方法成为可能。该方法在未来有望成为统一的法规。本文我们报道这一用于开发该方法所采用的逻辑思路和技术手段,以及为克服基本技术障碍而进行的实验研究和为验证其有效性而进行的相关测试。


2 材料和方法    


01 目标及监管环境的确定


“包装物理抗菌效果评估指南” 的制定是为了比较商用化妆品包装的性能,过程中要考虑到潜在最终配方及其各组成成分的物理特性(流动性)。该方法也可以用来比较尚处于开发阶段包装的性能,尽管在这种情况下,能够提供的真实保护效果是相对的。该结果应该与ISO11930(2019)和ISO29621(2017)描述的微生物风险评估程序相整合。实验可能被包装和化妆品行业采用才是重要的。因为工作人员通过需要进行无菌操作培训,并要求在必要的设备下,所有微生物菌株的生物风险能够必须达到二级或更低。目标之一是要考虑消费者的真实行为,因为这是污染的主要来源。因此,开发一个专门的体外污染程序用以模拟日常的使用行为。


02 细菌模型的选定


从经济易得的角度来说,很明显这个方法应该要做到使用单一微生物模型就可以获得结果。因此,除了必须达到二级或更低的标准以外,该关键微生物还应该满足以下要求:1. 存在于大多数工业现场的微生物库中;2. 好氧菌且易于生长;3. 大小适中,以避免包装保护性能可能的低评估;4. 经常存在于环境中和人类皮肤上;5. 可移动的,这样可以扩散避免死角也能被监测到。


综上考虑,选择了铜绿假单胞菌。所有的实验均选用ATCC® CRM-9027.  与其相当的 CIP®82.118,  NCIMB®8626,  NBRC®13275或 KCTC®2513也可以使用。


03 包装类型和制样过程


可以预测的对内容物只能起到一些低水平或者无防护性能的包装如罐和敞口瓶被排除在外。与此相对的,相当于药品级别的密封无菌一次性包装也被排除了。


因此本方法主要针对以下两种包装:1. 过度保护性包装,2. 绝对阻隔性包装,考虑到生产模式,至少随机选取50以上的样本量方能达到可信的实验结果。在实验之前,所有包装均采用适合其成分的技术(电离、高压灭菌等)进行去污。所有容器均在无菌条件下填充,并进行对照无菌实验。


04测试介质


过度保护性包装并不意味着能够完全阻挡污染。该方法需要考虑实际的使用情况,因此污染的操作至少重复了一周。尽管倒出样品的污染水平可立即测定,但是残留在容器中产品的污染水平只能打开后方能测定。考虑到细菌生长快速,很难判断初始污染发生的时间。因此有必要开发一个细菌培养基。此外,该培养基还必须添加一定的黏度调节剂以获得适宜的流动性,因为包装的性能需要与产品的流动性相适宜。


屏障性包装即使在重复提供剂量产品时也应当能够阻隔所有的微生物污染。因此,从这个意义上说,完全安全的阻隔性包装还有待开发,但是适用于低防护产品的高效阻隔性包装已经市场化。因此我们采用一种可育培养基通过铜绿假单胞菌对该类包装进行了实验。该类包装也通常用以盛装化妆品乳霜,而经典的可育培养基太容易流动,因此还需要用黏度调节剂对其进行调配。 


05污染过程


为了重现容器的常规使用情况,当其在无菌压片上分配剂量时,通过擦拭喷嘴的方式对其进行污染,无菌压片事先浸有浓度为10CFU/cm2的细菌。选取的细菌浓度与人体皮肤平均浓度相当。压片打开以便形成100×200 mm矩形,并插入无菌胃袋中,以确保其被均匀污染。细菌溶液分布在垫子的整个表面上,当袋子闭合后,通过从中心向周围施加温和的压力将液体进行分散。这个方法通过测试加有酚红的有色介质来验证分布的均匀性。


污染模拟实验在室温条件下进行了8天,如表1所示。考虑到第一天和第二天是用来作为控制实验,填充包装,对细菌进行传代培养,真实的污染程序从第三天开始启动,通过控制包装的无菌性以及上午和下午每隔6小时将其暴露于受污染的压片上。此后,从第4天到第7天,每天两次,每次间隔6小时,进行污染操作,如图1所示。收集两个样本。第一个是在第三天,首次日常污染之前的样品,用以作为控制实验。第8天,对1 g输送培养基中的细菌进行计数。然后,在无菌条件下打开包装,收集容器中剩余的部分产品,然后在皮氏培养皿上通过电镀法评估容器中产生的污染情况。


表1 污染模拟程序日程表

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为了确定倾倒部分样品的污染水平,每个样品进行称重,用 Eugon  LT100  介质分别稀释10倍和100倍,然后在类胰蛋白酶大豆肉汤(TSA)-琼脂固体培养基上进行电镀。Eugon  LT100需要先中和掉介质可能保留的抑菌活性,从而来进行过度保护性包装实验。CFU是在32.5 ± 2.5 °C条件下培养48至72小时后进行计数的。

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图1 标准化条件下再现皮肤接触造成的自然污染而制定的污染程序示例。(a)软包装:(1)按压包装的喷嘴使其接触已经污染的压片(106 CFU/mL),(2)按供应商推荐用量挤出产品,(3)当其完全恢复时,(4)包装上的压力消除,继续移动2 cm,以模拟手动擦拭尖端的过程;(b)适用于刚性包装,包装侧面的压力可通过驱动输送泵替换。


结论 

  

01抑菌和可育培养基的配方


有很多增强细菌活性的培养介质,相反,具有抑菌效果的培养基却很少,特别是对于比较通用的菌种铜绿假单胞菌来说。此外,尽管某些培养基能够保有48小时甚至72小时的抑菌活性(如Zwisler laboratorium培养基),但我们需要的是至少能够保持7天抑菌活性的培养基,以排除在包装性能评价过程中的任何人为因素。另外一个挑战在于需要调控培养基的流动性,以便于其能够与典型包装中化妆品配方的流动性相兼容。所有的物质还应该要考虑成本以及公司安全性的问题。


以Zwisler laboratorium培养基为基础,我们进行了一系列的实验,旨在开发一种对于铜绿假单胞菌具有至少一周抑菌效果的培养基,基础配方如下:

–  杜氏PBS缓冲液 (Thermo Fisher) 900 mL.

–  甘油 (Carl Roth) 100 mL.

–  硫酸镁 (无水) (Sigma Aldrich) 0.4 g.

–  苯酚红 (Merck Millipore) 5 mg.

–  低黏度羧甲基纤维素  (Sigma Aldrich) 25.0 g.

–  抑菌剂  (根据受试物不同改变百分比)


所有测试培养基均在第一天手中100 UFC/g铜绿假单胞菌。对于每一种实验的抑菌剂,分别测定7天类污染的演变情况,并用初试接种浓度对数变化值表示(Δlog菌落形成单位)。主要检测的抑菌剂如图2(酸)和图3(常用有机防腐剂)所示。如前所述,选择这些物质是因为他们成本低,且存在于大部分工业公司。盐酸(图2a)、柠檬酸(2b)和山梨酸(图2c)的实验是基于pH降低会抑制铜绿假单胞菌生长的假设进行的。而硼酸(图2d)的实验不仅基于酸性的原因,同时硼离子也具有抑菌的作用。其他常用防腐剂,如苯氧乙醇(3a),是因为其在化妆品中能够发挥广谱的防腐效能;对医药领域性能突出的防腐剂苯甲酸钠也进行了测试(3b)。对甲基异噻唑啉酮也进行了实验,尽管已知其具有皮肤致敏活性,但它是一类功能强大的合成杀菌剂(3d)。对尼泊金甲酯(对羟基苯甲酸甲酯,MOPB),E218号食品防腐剂,也进行了实验(3c)。这些物质均进行了宽范围的实验,但是图中仅显示了相关性较好的实验结果。初步研究中还测试了具有抗菌活性的皮肤调理剂癸二醇和已知可阻止细菌分裂的DNA回转酶抑制剂萘啶酸(数据未显示)


如图2a所示,pH = 5.39的盐酸表现除了抑菌活性,但是pH上的一点增加就使得该效应丧失,当pH 为5.45及以上时,培养基第一天的污染水平就已经超出了能够测量的上限(∞)。而对于柠檬酸来说,当pH为4.79和4.81时,部分阻断了铜绿假单胞菌的生长,而pH为4.94的柠檬酸则可作为抑制剂;在测试的浓度范围内(0.05%到0.1%),山梨酸对铜绿假单胞菌的生长完全没有抑制作用;而硼酸展现了良好的抑制效果,特别是在浓度为0.26%(pH = 6.00)和0.84%(pH = 5.41)时。更高浓度的硼酸对于铜绿假单胞菌来说,是致命的。铜绿假单胞菌对于苯氧乙醇的反应出乎我们的意料。除了最高浓度时(0.35%及以上),细菌都是先生长1-2天后才停止,可能是源于该物质的毒性。高达0.045%的苯甲酸钠只能在铜绿假单胞菌繁殖的初试阶段发挥阻碍作用,更高浓度0.05%的培养基中,第七天没有检测到活菌的存在。尼泊金甲酯具有不同的反应,抑菌效果根据浓度的不同有所差别,0.1%时抑菌效果有限,而0.15%时则表现出完全的抑菌效果。对于甲基异噻唑啉酮,第七天时0.001%浓度下毫无抑制作用,而0.002%则表现出完全的抑制效果。因此,除了硼酸,其他所有受试物有的在七天时间内无法抑制铜绿假单胞菌的生长,有的有效范围很窄(特别对于pH来说),会导致其重现性很难。因此,尽管在欧盟硼酸的使用受到限制,因其被划分为致癌物、诱变剂和再毒性(CMR)1B或2级,但是从浓度方面考虑,最终选择硼酸进行培养基的配制。



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图2 不同酸存在下产生的抑菌效果对比,测定了七天类污染演变的情况,结果用初试接种浓度的对数变化大小进行表示(a:盐酸,pH = 5.39绿色线,pH = 5.45蓝色线,pH = 5.63红色线,pH = 5.91橙色线;b:柠檬酸,pH = 4.79绿色线,pH = 4.81蓝色线,pH = 4.94红色线;c:山梨酸 0.05%绿色线,0.1%蓝色线;d:硼酸,0.84%,pH = 5.41绿色线;0.26%,pH = 6.00蓝色线)。所有的实验均重复三次,且完成了更高和更低浓度的实验(此处未显示)


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图3 不同有机防腐剂存在下培养基抑菌效果对比,测定了七天类污染演变的情况,结果用初试接种浓度的对数变化大小进行表示(a:苯氧乙醇,0.3%绿色线,0.32%蓝色线,0.35%红色线;b苯甲酸钠 0.01%绿色线,0.03%蓝色线,0.04%红色线,0.05%橙色线;c:尼泊金甲酯0.1%绿色线,0.12%蓝色线,0.15%红色线;d:甲基异噻唑啉酮,0.001%绿色线;0.002%蓝色线)。所有的实验均重复三次,且完成了更高和更低浓度的实验(此处未显示)


但是,第一代的培养基黏度太低了,尽管已经添加了羧甲基纤维素。因此使用多种网状剂进行了第二批次的试验。首先采用目测法预估配方的黏度,其中黏度合适的配方再使用带有同轴圆柱和CC25 DIN/Ti间隙的粘度测试仪IQ Haake进行测量。考虑到大多数典型化妆品乳液的平均黏度范围(2518,000  ± 3000 mPas,25°C,剪切速率 15s−1 ),选用羟乙基纤维素(HEC,25 g/L)  对抗菌培养基进行配制。因为任何的改变都会影响培养基的抑菌性能,因此使用100 CFU/mL的铜绿假单胞菌接种物对其活性进行验证。根据标准指南(ISO 2114),根据最大变化<50%(0.3 log)进行验如前所述,选择可育培养基是一件相对简单的任务。它包含硫酸铜、甘油和苯酚红。为了保证配方的类似性,三者的浓度和其在抑菌培养基中的一致。用大豆胰蛋白酶肉汤(TSB)代替DPBS以促进细菌生长。但是,TSB的使用改变了介质的流动性,需要将网状剂(HCE)的用量增加到25.7 g/L,以获得相同的流变特性。


表2 测试的网状剂和培养基的表观流动性

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02 过保护和阻隔包装的对比试验


由五家不同化妆品生产商提供的16个系列共50种包装进行了实验,每个样品一式两份。这些测试由七名不同的操作者进行。这其中包括了来自三个不同厂家的五种不同保护水平的包装(可能是过度保护或阻隔保护)。包装均进行了匿名化处理且只能通过信件进行识别。负责测试的实验室并不知道这些包装的来源。实验结果如表3所示。包装A只能提供有限的保护,所有倒出的样本1和2都被污染了,微生物含量高(不超过30%的倒出样本包含了少于1000UFC的污染物)。包装B的保护效果要稍好一些,尽管有的倒出样本含有大于1000 UFC的污染物。包装D的保护效果要更好一些,所有倒出样本的污染水平均在1000 UFC以下,但是这种表现有点反常。在所有的测试中,包装C和E的防护效果最好。正如过度保护或阻隔包装所预期的那样,所有测试的包装都能完全保护残留内容物的安全。


表3  使用中测试结果


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测试了16个系列50种包装,并进行了重复实验。为便于比较,结果用包装测试数量的百分比表示。



讨论   


面对为保护低水平和无防腐剂化妆品而提出的各种技术解决方案,统一标准的存在对包装界和化妆品行业都是有益的。除了法规外,也有很少的几项研究验证了化妆品包装对于微生物安全性的作用。但是,然而,本研究首次在宽范围的包装上进行了实验方案的验证,并将其与分类网格相关联,允许根据包装所赋予的微生物安全程度对其进行区分。

铜绿假单胞菌之所以被选为模型,因为它不仅是被列为挑战性试验的微生物(ISO 11930 2019),而且存在于大多数工业场所的微生物库中。此外,该菌容易生长,尺寸适中,在环境中分布广泛且其极性鞭毛的存在使得其能够移动。它的缺点在于属于2级安全微生物,因此需要特定的设施。它比安全等级1的物种如荧光假单胞菌更为合适,因为荧光假单胞菌在工业上并不易获得,也不易使用,而我们的目标是希望开发的方法对包装的生产者和使用者都能适用。除了它的多功能性之外,选择铜绿假单胞菌的原因也在于难以配制一种能将其抑菌活性保持7天的培养基。这些看似微不足道,但是尽管在文献中很容易找到抑菌和可育培养基,但这是首次对铜绿假单胞菌抑菌培养基进行详尽的研究,特别是在这么长的时间范围内。相比于其他受试物,硼酸在抑菌培养基中更加有效,这一结论能够从它在临床上长期被用作尿液样本运输中的防腐剂获得支撑。最近,也有人提议将硼酸用于兽医领域的尿液样本保存之用。主要的限制来源于欧洲化学品管理局将硼酸划分为有害物(依据暴露量的不同,分为CMR2或1级)。本研究采用最大浓度0.485%的硼酸(质量/体积)。因此,只有在进行散装物料操作时才需要CMR保护防护措施。

开发这个在用污染评价手段关注的另一个重要方面在于重现消费者的日常行为。这是非常重要的,因为对于化妆品来说,与皮肤接触且皮肤上天然存在的微生物群是污染的重要来源。此外,在未完全关闭的情况下,擦拭出口可产生有限的压力,会导致倒出的产品回流到容器中,并污染容器。另外一个问题,连续使用会导致一定量产品暴露在出口处,这足能引起活跃细菌的生长,并导致产品在倒出过程中受到污染。如图1和表1显示的污染方法是为了评估两个参数:倒出样品的污染情况和容器内的可能污染情况。想考察包装在包括生产和存储整个生命周期的微生物防护情况不太可能,但为期7天的在用测试看似是与法规要求的验证方法一致。此外,该验证实验室是在一系列50个包装上开展的,以说明质量的正常可变性。实际上,包装通常不是一个接一个地生产,而是使用多形式的模具,尽管有控制措施,但并非所有的性能都完全相同。

鉴于结果,我们把包装分为从0到5六个等级。0对应完全无防护性能,5则是能够提供完全的保护。在本实验中测试的过度性保护和阻隔性保护包装,根据测试过程中的污染样品的百分比,分别对应在2-4级之间。在所有这些包装中,内容物都没有被污染。3级和4级包装可通过可育培养基上的测试进行区分,这是最具鉴别性的,因为只有4级包装才能通过图4所示的测试。这个方法的目标对象是大众只用的产品,并希望能够被包装界和化妆品行业所有感兴趣的生产商采用。建议在产品的标识文件上打印一个标识。该标识可存放于用于保护知识产权的法国有机体机构中,归化妆品谷集群所有。其使用是免费的,但仅限于化妆品包装,并要求包材符合表4总结的标准。


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图4 包装微生物防护等级分类流程图


表4 按照对微生物防护效能不同对包装进行的等级划分及依据在用实验确立的各等级标准


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*如果内容物直接接触和环境污染,包装可视为0级,无需进行任何初步试验。


总之,本研究汇集了过去5年化妆品和包装行业的一些主要合作伙伴,得出了首个完整及经实验验证的结论。依据该结论,可根据预期要提供的防护水平,为产品选择合适的包装。该结论可被用于根据允许根据预期的微生物保护水平选择化妆品包装。这项工作已经提交给了国际标准化组织成员大会(Crozier 2018b;Feuilloley and Roullet 2018),他们现在正在考虑将其翻译成新国际法规。

原文链接:https://doi.org/10.1186/s13568-020-01016-4


翻译:余述燕  郑州轻工业大学

编辑:张同艳  郑州轻工业大学

审核:张太军  荃智美肤生物科技研究院


注:本文非广告,仅供专业人士作为学术交流目的阅读和参考,不具有商业推广或者服务目的。本文著作权归作者所有,如需转载,请联系编辑人员,对未经许可而进行复制或传播本文内容的行为,将依法追究责任。


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