紫外线照射下, 氧化锌对防晒成分功效和毒性的影响（一）

原文：Aurora L. Ginzburg,Richard S. Blackburn,Claudia Santillan,Lisa Truong,Robyn L. Tanguay, James E. Hutchison. Zinc oxide‑induced changes to sunscreen ingredient efficacy and toxicity under UV irradiation.Photochemical & Photobiological Sciences (2021) 20:1273–1285

摘要：防晒霜的安全性和功效通常是根据配方中个别化学物质的特性来评估的。然而，防晒霜的光稳定性已经被证明高度取决于其中的化学物质混合物。为了更好地了解防晒配方如何影响稳定性，并为探究氧化锌添加剂的影响奠定基础，我们配制了五种不同的基于小分子的紫外线过滤（UV-过滤）混合物，防晒系数 (SPF) 为15。这些混合物含有美国或欧盟批准的活性成分，旨在代表市场上实际产品的配方。我们在紫外线照射两小时后评估了这些混合物在氧化锌不存在和存在下的光稳定性和毒性。对于所有五种不含氧化锌的小分子混合物，UV 吸光度的变化很小。而微米级或纳米级氧化锌的存在导致显著的小分子光降解，并且降解的混合物在胚胎斑马鱼试验中表现出更高水平的毒性。这项研究表明，在配制同时含有氧化锌和小分子紫外线过滤剂的防晒霜时必须小心谨慎，以避免在使用过程中产生意外的后果。

1、引言

防晒霜的功效和安全性对人类健康1和环境2都至关重要。可作为防晒活性成分使用的化学物质的有限清单3,4令人担忧，特别是考虑到对新兴成分的监督2,5,6,7。在过去的几年中，关于基于小分子的防晒霜对人类健康和水生环境的潜在危害的研究已经被广泛报道2,5,8,9。截至 2021年6月，美国食品和药物管理局 (FDA) 防晒霜专论仅列出了16种紫外线过滤剂 (UV-filters)（防晒霜中的活性成分）被批准添加到化妆品中。其中包括八种主要在 UV-B （280–315 nm）吸收的有机化合物；在 UV-B 和短波 UV-A（315-340 nm）区域吸收的四种有机化合物；但只有两种有机化合物主要在全（短波和长波）UV-A （315-400 nm）中吸收 。覆盖 UV-A 的过滤剂尤为重要，因为到达地球表面的紫外线辐射中高达95%是 UV-A 10,11。FDA还批准使用两种阻碍 UV-A 和 UV-B 传输的无机“过滤剂”，即二氧化钛 (TiO2) 和氧化锌 (ZnO) 3。 二氧化钛和氧化锌通常分别用于阻止 UV-A 和 UV-B 的透射12,13。

考虑到它们的科学、商业和流行用途，围绕紫外线过滤器类型的命名很重要。有时，小分子紫外线过滤剂被描述为“化学过滤剂”，是认为这些化合物通过紫外吸收发挥作用；“物理过滤剂”有时被用来描述矿物纳米和微粒，与通过散射抵御紫外光的保护机制有关。但这是不准确的，因为无机矿物过滤剂也被证明具有吸收作为保护13的重要机制。此外，一些有机过滤剂，如二氧化钛，是通过散射和吸收机制发挥作用的。此外，“化学过滤剂”一词可能意味着矿物过滤器不是化学物质，这当然也是不准确的。因此，当需要时，我们将使用“小分子”和“矿物”来区分过滤剂类型。

公众对防晒霜安全性的认知，促使市场热衷于使用某些成分，限制其他成分的使用，但基于的数据证据相对缺乏。由于公众的看法，近年来出现了两种趋势。首先，由于担心氧苯酮对珊瑚礁的危害，氧苯酮基本上已经停用。2 2021年1月1日，夏威夷州禁止销售和分销含有氧苯酮或甲氧基肉桂酸辛酯14的防晒霜配方。其次，含有二氧化钛和氧化锌的无机防晒剂越来越多地作为小分子（“化学”）防晒剂的更安全替代品上市销售5,6。然而，产品安全声明似乎忽略了这些产品中金属氧化物的紫外线照射可能导致的危害，包括已被证实的活性氧(ROS)15,16的产生和有机化合物的降解。

与美国相比，欧盟有28种被批准用于化妆品的紫外线过滤剂，其中包括9种吸收UV-B的有机化合物、7种能吸收UV-B和短波UV-A的有机化合物、4种吸收UV-A的有机化合物、4种具有广谱紫外吸收能力的有机化合物。二氧化钛和氧化锌也得到了批准，包括它们作为纳米粒子的使用（带有特定的危险标签、规格和浓度限制）。

 然而，二氧化钛最近也被欧盟法规列为第2类疑似吸入致癌物7，现在要求对含有可吸入二氧化钛的相关产品发出警告。目前尚不清楚喷雾式防晒霜如何符合这一修改后的规定，也不清楚二氧化钛在任何防晒霜应用中的使用期限。此外，欧盟允许使用两种有机化合物，二氧化钛和三联苯基三嗪，它们以纳米颗粒形式配制，使它们能够作为物理-化学混合物发挥作用，提供紫外线吸收和散射18,19。在欧盟，配方商可获得的批准化合物种类较多，这促使我们研究美国和欧盟成分的安全性，以确定将配方危害降到最低的策略。

虽然消费者已经意识到防晒霜成分的潜在危害，但有一个重要领域尚未引起公众的注意，即防晒霜/紫外线过滤器的光降解和降解产物的毒性。目前已观察到紫外线过滤剂在紫外线诱导下发生化学降解；然而，这些反应的时间和程度取决于每个配方的成分20-24。最常见的紫外线过滤剂已经通过光稳定性测试，并且已开发出配方策略以防止被快速分解20。特别是 UV-A 过滤剂，通常不具有光稳定性，并且在紫外线照射下会迅速降解，导致紫外线吸收率显著降低，从而降低其功效25,26。例如，阿伏苯宗是少数获得 FDA 批准的 UV-A 过滤剂之一，已知会发生光降解25。添加足够量的阿伏苯宗时，添加奥克立林（一种 UV-B 和短波 UV-A 过滤剂）可以帮助稳定阿伏苯宗27,28。光降解产物对配方毒性的影响尚不清楚。当一种防晒霜成分被确定为无毒且对配方安全时，评估只是基于对纯化学成分的评估，而不是任何光化学物质产生的物种。考虑到有许多研究表明防晒霜在紫外线照射下可以快速反应20,24,27-30，特别是使用环境（例如，晴天的室外），令人惊讶的是几乎没有对光降解产物进行毒性测试20,29。

在此，我们的目的是研究来自欧盟和美国的市场上相关紫外线过滤混合物的光降解和辐射后的毒性。光谱分析阐明了紫外光如何影响混合物成分和紫外线防护。 在胚胎斑马鱼试验中评估了混合物的毒性。选择斑马鱼作为是基于与人类显著的基因同源性，以及与哺乳动物研究31相比进行更高通量筛选的能力。更快速的筛选使我们能够进行体内研究，以具有统计学意义的方式测试一系列混合组合。此外，斑马鱼模型通常用于了解水生生态毒理学32；因此，斑马鱼试验可用于预测防晒霜降解物对水生生态系统的危害。

2、材料与方法
2.1  材料
所购化学品均为化妆品级或以上。当通用名称不同时，采用国际化妆品成分命名法 (INCI) 的名称。胡莫柳酯（CAS：118-56-9）， 奥克立林（INCI：2-乙基己基酯；CAS: 6197-30-4），氧苯酮（INCI：二苯甲酮-3；CAS：131-57-7），以及阿伏苯宗（INCI：丁基甲氧基二苯甲酰甲烷；CAS: 70356-09-1）购于makingcosmetics.com，MakingCosmetics Inc.是一家美国FDA注册、ISO认证和OTC许可的cGMP/FDA成分供应商，总部设在美国，为企业和个人提供化妆品成分。33 奥替柳酯（INCI：水杨酸辛酯；CAS：118-60-5) 购自 TCI Chemicals。DHHB（INCI：二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸己酯；CAS：302776-68-7；作为物化结合）和二氧化钛（INCI：亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基苯酚；CAS：103597-45-1；作为广谱防晒 50% 的紫外线过滤剂水悬浮液样品），购自 BASF。所述氧化锌微粒（以下简称氧化锌微粒；CAS: 1314-13-2）购于makeingcosmetics .com；不含其他金属杂质，粒径在200-1000 nm之间，由锌高温汽化制备而成。建议以5-25% w/w浓度添加到产品中，美国最高限量为25%。

纳米氧化锌（以下简称氧化锌纳米颗粒；CAS：1314-13-2），从makingcosmetics.com购买，商业名称为“纳米氧化锌”， 被描述为具有粒径 < 100 nm 的颗粒，平均尺寸为 85 纳米；建议在有机防晒霜中添加3-6% w/w或单独使用时添加3-20% w/w。这两种类型的氧化锌颗粒都是以一种被称为“未包裹”（uncoated）的形式购买的，这与氧化锌被硅衍生物包裹的“包裹”（coated）形式不同。

2.2  紫外线过滤混合物配方
我们评估了来自美国和欧盟市场的26种在售的防晒霜的成分。从这些数据中，我们确定了常用组合紫外线过滤剂（活性成分）的趋势，并设计了五种市场相关的紫外线过滤剂混合物（见表 1）。 我们通过使用 BASF 的在线防晒霜模拟工具34来确定每个过滤剂的浓度，以生成预计防晒系数 (SPF) 为 15 (± 0.4) 的公式。 BASF的工具还应用了基于欧盟、澳大利亚和南方共同市场协议的“通过/失败”标准，该标准比较了体外 UVA 保护因子（ISO 24443）和体内 UVA 保护因子（ISO 24442），并考虑了较高数值34，以确定配方是否能达到合适的 UV-A 防护水平。 所有混合物都设计为通过该标准获得 UV-A“通过”。

为了配制混合物，将原料称量并溶剂化为二甲基亚砜（DMSO）。之所以选择二甲基亚砜作为溶剂，是因为这些混合物最终将在斑马鱼毒性试验中进行评估，而二甲基亚砜是一种常见且耐受性良好的共溶剂，用于将水不溶性化学物质输送给斑马鱼35。虽然二甲基亚砜永远不会出现在市场防晒霜中，但它确保了化学品有效输送到鱼类，在检测中使用的数量对斑马鱼无毒，并被纳入背景控制，以确保数据中包含二甲基亚砜的任何微小影响。将紫外线过滤剂溶液相互混合，并加入适量的二甲基亚砜，使化学品的最终浓度达到表 1 中所列的量，每种混合物的总量为 3 克。

为了制备含氧化锌的混合物，将3g“混合物1”的少量等分液与6% (w/w)的氧化锌粒子（微粒或纳米粒子）结合在一起。氧化锌的加入会产生较厚的悬浮液，因此悬浮液在移液之前会立即产生涡流，以确保混合物的代表性采样。用与小分子混合物相同的方法辐照并稀释含有氧化锌的混合物。

图S1中光谱的乳液是根据配方防晒乳液36的典型工业方法配制的，下面描述的每种成分以百分比表示，代表最终配方中每种成分的重量相对质量(w/w)(总质量为100%)。通过在搅拌下将甘油 (3%) 和 EDTA 二钠 (0.2%) 溶解在水 (65.7%) 中制备水相，并加热至 75°C。另外，通过混合苯甲酸 C12-15 烷基酯 (8%)、鲸蜡醇 (2%)、黄原胶 (0.3%)、硬脂酸甘油酯 (1%)、ceteareth-20 (2%)、阿伏苯宗 ( 1.8%)、高水杨酸盐 (7%)、辛二酸盐 (4%) 和奥克立林 (5%) 并在搅拌下加热至 75 °C 直至所有固体溶解。然后在 75°C 下通过与均化器混合直到获得乳液将两相合并。然后在搅拌下将所得乳液冷却至室温（25°C）36。值得注意的是，任何可能由加热引起的乳液成分的降解都将通过实验来解释，因为所有光谱（紫外线照射之前和之后）都是在乳液配制和冷却后收集的（图 S1）。

2.3  紫外线照射
使用前将所有混合物充分搅拌以提高均匀性，然后取出 3 µL 等分试样并放入没有任何锥形的小玻璃瓶中，以确保小玻璃瓶不会阻挡紫外线光束。 将小瓶暴露在太阳模拟器（Newport Oriel Sol3A）上，使用AM1.5 G入射光谱1，测量的总功率密度为104 mW cm-2，持续120分钟。使用美国国家可再生能源实验室网站上的标准1.5G太阳光谱数据和ISO/CIE 17166中报告的红斑光谱加权函数，确定该太阳模拟光谱0.018%（相当于0.019 mW cm-2）的红斑有效辐射量。通过将此有效功率密度乘以曝光时间（7200 秒），该值可以转换为标准红斑剂量 (SED)41。 SED 定义为 100 J m-2 的红斑相关暴露40，因此，太阳模拟器在两小时内向样品输送了13.8 SED。由于暴露水平与人类紫外线暴露直接相关，因此将其与紫外线指数 (UVI) 联系起来非常重要。2 UVI 与 SED 数量之间存在简单的数学关系：每小时红斑剂量(J m−2)   = 90 × UV (J m−2)   = 0.9 × UVI (SED) 。因此，如果 UVI 为 10，一个人在充足的阳光下每小时将接收 9 个 SED；如果 UVI 为 6，则每 11 分钟传送~1 个 SED。因此，在我们的实验中，太阳模拟器提供的 13.8 SED 相当于在 UVI 10 下暴露 92 分钟，或在 UVI 6 下暴露 153 分钟。

对照实验表明，暴露2小时后，二甲基亚砜没有明显的蒸发。暴露测试样品后，将97µL的二甲基亚砜添加到小瓶中并涡旋。这些溶液随后被用于毒性和光谱分析。对照样品，不暴露于紫外线照射下，以相同的方式制备，但在照射期间，它们在黑暗中保持开放，这是因为二甲基亚砜的吸湿性，考虑到在两个小时的时间内吸收的水分。

2.4  吸光度测量
从100µL小瓶中取出等分的辐照混合物和对照混合物，并稀释到 99% 的水或异丙醇 (IPA) 中。将200 µL99:1 溶液放入 UV-STAR® 微孔板中以测量吸光度。使用BioTek Synergy 2 酶标仪与 Gen5 1.11 软件。 扫描在 280 到 700 nm 之间以 2 nm 步长进行，并且 99:1 溶剂被减去背景。由于较长的波长没有吸收，即使在降解后，也仅显示 UV 区域（280–400 nm）。 当一式三份进行时，吸收光谱有3%的变化。

2.5  制备动物暴露溶液
将装有50µL 二甲基亚砜浓缩液的玻璃小瓶放入50 mL的falcon试管中，在64×g上离心3分钟。离心后，用手指轻弹试管底部，以帮助混合化学物质。将样品稀释到超纯（UP）水和二甲基亚砜的混合物中，达到10 ×曝光溶液。然后将每10 ×暴露溶液中的10µL加入每孔90µL的UP水中，最终浓度为1% 二甲基亚砜，混合物浓度见表S1。

2.6  斑马鱼养殖/发育暴露
热带 5D 野生型斑马鱼被安置在俄勒冈州立大学的 Sinnhuber 水生研究实验室，在 14 小时光照/10 小时黑暗循环下。鱼在装有约 500 条鱼/50 加仑水箱的水箱中饲养，水箱中装有反渗透水，补充海水(0.6%)，并保持在 28°C (± 1°C)。他们的饮食包括适当大小的 微型胞芽（法国Skretting 公司），每天两次。斑马鱼在前一天晚上在带有产卵漏斗的水箱中成群产卵，第二天早上收集胚胎。根据先前描述的程序42对胚胎进行分期，并在胚胎培养基中保持在28°C的孵化器中。胚胎培养基的组成为15mM NaCl、0.5 mM KCl、1 mM MgSO4、0.15 mM KH2PO4、0.05 mM Na2HPO4 和 0.7 mM NaHCO3。43 在受精后 4 小时 (hpf)，使用自动去绒毛膜仪和 83 µL 的 25.3 U µL-1 链霉蛋白酶（美国 Roche 公司）去除绒毛膜。44 胚胎被转移到含有 100 μL 暴露溶液的 96 孔板的单个孔中，在那里它们静态暴露直到 120 hpf（N = 12）。将板用石蜡膜密封并以235rpm振摇过夜。在 24 和 120 hpf 时对胚胎进行了总共 22 个终点的评估。45
(未完待续)

来源：荣格-《国际个人护理品生产商情》


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