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您的生物制剂是否存在 “蛋白质聚集”的风险?

来源:来源:荣格-《国际医药商情》     发布时间:2021-04-27
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在无菌注射剂的生产中,大分子药物生产的生命周期中存在蛋白质聚集的风险。虽然预充式注射器特别敏感,但西林瓶和其他容器类型也存在风险。生物原液的生产过程,运输和储存条件的一系列触发因素可能导致蛋白质聚集或结块。如果患者服用受损的药物,他们的免疫系统可能会认为修饰的蛋白质是有害的,并攻击它们(一种免疫原性反应)。副作用程度从轻度到重度,可能包括嗜睡、头痛或腹泻,甚至是栓塞、内出血或死亡。

什么因素诱发蛋白质聚集?

蛋白质在其结构的外部和内部自然都有疏水区域。但某一个原因触发蛋白质展开然后错误地重新折叠时,它们的结构就会发生变化,暴露了许多以前埋藏的疏水性“片层”。这些片层像磁铁一样相互吸引,导致变形的蛋白质聚集在一起。有时即使蛋白质保持完整但整个溶液的平衡受到干扰时,也会引起级联事件,触发蛋白质分子聚集。
多种因素可引起蛋白质聚集。下面是一些最突出的因素。

硅油
硅油是一种普遍用于生产预充式注射器和西林瓶的润滑剂。在灌装前将硅油喷洒在预充式注射器内,使橡胶塞能够在给药期间沿玻璃针筒滑动。硅油喷涂在瓶塞上,有助于瓶塞在灌装和压盖工艺期间滑动到位。
在发生蛋白质聚集时,硅油始终是一个主要的怀疑因素,因为它通常与蛋白质相互作用,并可能触发聚集过程。如果疏水性硅油液滴最终进入您的溶液中,它们可以吸引您蛋白质上的疏水片层,并导致其聚集。
一些公司使用“烘烤”硅油作为预充式注射器。加热干燥的烘烤硅油比液态硅油更牢固地粘附在玻璃针筒壁上,液态硅油会自行干燥。虽然烘烤硅胶不太可能滴落,但会形成痂层。当填充注射器时,这些痂层脱落到溶液中,类似加入了造成蛋白质聚集的“种子”---此外,这还会导致您的药物不符合要求。

氧化剂
氧化物质是强效聚集剂。它们可能会损害蛋白质结构,在某些情况下会破坏蛋白质结构,将其分解成更小、反应性更强的结构,使您的蛋白质无用和/或对患者有害。生物制剂可能接触的一些最普遍的氧化剂包括—
钨:预充式注射器中存在的钨残留物是一个众所周知的问题。多年来进行的研究证明钨对蛋白质有负面影响,即使是微量水平也是如此,而这在玻璃注射器中很常见。钨在注射器本身的生产过程中起作用。当玻璃仍具有延展性时,将钨针推入和推出针筒,可形成针头将要插入的孔。在该过程中,热玻璃将钨离子从针中浸出并残留在注射器颈部,在那里存在微量的钨。一旦将生物制剂灌装至容器,这些离子就可以析出到蛋白质溶液中。随着时间推移,钨可能因蛋白质聚集或降解副产物而使您的药物无效或不安全,这个时间的长短取决于药物对氧化和储存条件的特定敏感性,短的可能在数天内发生。


过氧化物:过氧化物是极强的氧化剂。过氧化氢通常以蒸汽形式用于对注射液灌装间灭菌,可产生对蛋白质危害极大的自由基过氧化物。[4]仅仅是微量,甚至十亿分之十的过氧化氢也可触发氧化和蛋白质聚集。
光照:直接或间接光照可降解(氧化)生物制剂中的蛋白质或辅料。

pH值和温度
在配制过程中,通常通过控制pH值和温度来为其他辅料的添加创造最佳环境以获得稳定的制剂。然而,考虑到pH和温度对蛋白质结构的影响,pH和温度的波动可成为蛋白质聚集的强大催化剂。
当您调节溶液的pH水平时,通常在混合过程中会发生pH变化。灌装后,不太可能发生pH值波动,除非您的制剂具有高 pH值和高盐浓度,而且玻璃与您的制剂匹配不佳。这一结合可改变pH值并导致玻璃降解(腐蚀)以及形成玻璃颗粒。


在配制和生产后(如运输或储存期间)均可能发生温度波动。温度的波动可导致硅油、橡胶塞、顶空和制剂间发生不良相互作用,导致西林瓶和预充式注射器中的蛋白质聚集。某些条件下,聚集物也可能在预充式注射器的胶塞周围形成痂层,这可能阻止或阻碍柱塞移动。

制剂组份
选择正确的辅料是稳定产品配方的核心。辅料必须与您的蛋白质具有“相容性”,并以正确的方式、正确的时间和正确的量添加;否则,您的蛋白质迟早会聚集,您的药物会变得不稳定。
我们将在本系列的第3篇中详细讨论配方组分。


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聚集的其他原因
不锈钢:大多数灌装设备是不锈钢材质,因为它相对来说呈惰性,但一些蛋白质并不“喜欢”不锈钢材料。它们会将离子从钢中浸出,进而使蛋白质发生氧化。
橡胶:蛋白质可与疏水性橡胶表面相互作用。而且,橡胶中含有数十种化合物,可以浸出至您的溶液中,或者您的溶液可以从橡胶中提取出这些有害化合物。
顶空:顶空可提供促进外力作用于气液界面的环境,如运输过程中震荡导致的泡沫和剪切应力,从而导致蛋白质聚集。
振动:运输振动本身或结合其他因素(如顶空、颗粒物和/或硅油)可能触发聚集。
气压(预充式注射器):在空运过程中,气压变化可以使注射器柱塞来回移动 1 厘米(2/5 英寸),具体取决于顶空情况。 这足以使胶塞从针筒壁上刮下硅油颗粒,并让颗粒进入溶液中。(气压不影响西林瓶,因为西林瓶的胶塞由铝密封件紧密固定。)

聚集风险影响因素试验

评估蛋白质聚集倾向的简单方法是评价在产品开发期间确定的产品理化属性。开展侧重于对最终容器施加极端条件的研究非常有启发性,有助于防止患者暴露于潜在安全危害中。这些变量可能包括:

对于预充式注射器和西林瓶
●  在不同温度和湿度水平下储存容器
●  通过在各种条件下振摇容器模拟运输条件,例如存在顶空、静止-运动循环、可变转速和温度
●  检测光照条件
●  检测顶空气体的性质(氮气与氧气)
●  向制剂中加入表面活性剂或氧化剂,以模拟机械和储存温度的极端条件引起的聚集和/或氧化

仅适用于预充式注射器
●  检测是否存在顶空
●  调整大气压力,以便通过胶塞推杆诱导移动
●  一旦样品受到极端条件影响,通过测定其滑动力和松动力的变化等方法来评估器械的机械操作特性。如果蛋白在柱塞周围聚集,形成一个痂层环,预充式注射器的功能可能会受到影响。

查看结果:
●  产品外观
●  蛋白质聚集体或片段水平
●  生物学活性
●  微粒和形态描述
●  氧化和/或脱酰胺化水平
随着时间推移和储存条件的改变追踪这些指标,这是全面稳定性研究的一部分。具体使用技术取决于蛋白质分子本身和执行实验室中分析试验和/或仪器的情况。
确定您的蛋白质在各种储存和运输条件下可耐受的具体量,可以帮助您在生物制剂开发过程中避免返工。这有助于确保患者使用时药品的质量保持不变。


通过生产工艺和容器选择
预防蛋白质聚集


假设您的药物项目已达到临床试验IIb期,您的药物研究正在有条不紊地进行中。现在已经结束了实验室阶段,进入小规模试生产阶段,您正在将生物制剂配制成制剂,这时,蛋白质突然从您的溶液中沉淀出来。发生了什么事?


无菌注射剂的生产充满风险,特别是在生物制剂中的蛋白质聚集方面。在本文的第 1 部分中,我们讨论了蛋白质聚集的原因以及您如何对药物进行极端条件试验。现在我们将讨论如何采取步骤来帮助预防蛋白质聚集。

1. 生产工艺
如何生产您的生物制剂?事实上,生产工艺本身可以保护您的蛋白质不发生聚集。以下是一些主要考虑因素。

极端条件点
考虑您的制剂从配制至灌装期间遇到的所有极端条件点。每一个极端条件点都起着重要作用。目标是通过采取下列措施将蛋白质受到的 极端条件降至最低:
让混合时间更短、混合幅度更温和:许多蛋白质对剪切力敏感。由于混合过快或过强,您的蛋白质会相互碰撞或相互摩擦,从而产生摩擦,从而使蛋白质变形,产生聚集。此外,尽量减少混合时间将减少您的蛋白质暴露于潜在不稳定因素的机会,如钢和空气(氧气)。轻轻混合还可减少向混合物中添加的任何表面活性剂产生的过量泡沫,后者可能触发聚集。


控制添加成分的顺序和速率:您添加蛋白质和辅料(化学物质)成分的方式会使您的生物溶液变质或破裂。因为每种蛋白需要其溶液具有特定 pH 值才“开心”,因此必须首先添加调节 pH 值的化学物质,否则就有变性的风险。有时,活性或非活性成分依赖于辅料才有效。例如,易于氧化的活性成分可能需要首先使用“氧清除剂”,使溶液更友好,以便使活性成分溶解而不会受到损害。


您如何添加每种辅料也很重要。您是否可以大批量快速添加以节省时间?或者,是否因为该化学品溶解性不佳,所以必须以细粉形式缓慢加入?当然,您添加的物质、添加的时间及添加的方式都是相互关联的;面临的挑战是在所有的成分之间找到正确的平衡,以便能够避免对其他成分或溶液整体产生不利影响。
尽量减少pH调节的大幅波动: pH值的波动很容易使您的蛋白质结构变形,是配制过程中最大的问题之一。为了减轻潜在的波动,缓慢加入 pH 调节剂,如果可能,使用低浓度。此外,在可能情况下,选择较弱的pH调节剂,而不是强酸或强碱。另一种方法是尽可能先调整pH值,这样当您的蛋白质碰到混合容器时,会遇到更均一的介质,从而减轻对分子结构的压力。


控制液体中的氧气水平: 氧气是蛋白质的主要威胁。在配制过程中向您的溶液中喷洒氮气将挤占氧气的位置,这样会防止氧化。某些制剂可能需要在生产操作的灌装和加盖阶段进行氮气覆盖。
控制溶液温度: 正如我们在第1部分中所讨论,温度波动可引起蛋白质解折叠和聚集。可以在配制容器上使用温度控制水套,这是在配制过程中维持适当温度的最简单、便宜和常见的方法。
控制无菌灌装间的卫生: 如果您的灌装区使用过氧化氢蒸汽(VHP)消毒,则进行研究从而证明当您的药物进入 限制 屏障系统(RABS)准备罐装时不会残留高水平过氧化氢。

生产途径
检查您的药物生产过程中的每一步,以保护其免受潜在危害。
过滤:选择适当类型的膜(疏水性或亲水性,具体取决于制剂)和流速(筛分类型)将有助于保持剂型完整。这有助于您的蛋白质溶液安全地通过膜,而不会过度起泡或吸附辅料(例如捕获表面活性剂),这可能会改变您的最终产品配方。


溶液路径:管路可能吸附制剂成分。即使制剂中少量的关键化学成分被除去,例如微生物制剂苯甲醇或者表面活性剂聚山梨醇酯,都可能影响药物的稳定性,使其更容易发生聚集。选择正确的管路类型(材料)或过滤器可防止特定辅料吸附。如果不可能实现,则减少流路、提高流速或在设置后冲洗管线或长时间管线停止是行业内的常见做法。


光线:如果您的蛋白质或配方中的任何组分容易发生光氧化,您可以考虑避光保护溶液,例如在灌装室内使用琥珀色或昏暗照明。您也可以使用带防护罩的容器、琥珀色西林瓶或不透明外包装容器,这也是对光敏感药物采取的常见措施。


目测检查:尽管在如今的生产环境中必须进行自动目测检查(AVI),但它也可能对生物制剂构成威胁。AVI 系统检测最终灌装容器中的缺陷时,依赖于高速、高清晰度的数码相机和电流。在 AVI 期间,制剂会在很短的时间内受到三个因素的极端条件影响:
强光,可对生物制品产生光氧化作用
快速旋转容器(转速高达4000 rpm),可剪切分子
高压电流(用于检测不可见的裂纹、泄漏或针孔),可在容器顶空产生强氧化剂—臭氧。
为了确保您的药物安全上市,针对 AVI 操作引起的对最终容器的即时和延迟影响开展研究非常重要。

2. 容器选择标准
与药物容器相关的许多变量可能触发蛋白质聚集,这些变量包括运输和储存条件、橡胶组分、硅油和钨。
为确定最能保护您生物制品的容器,建立一个容器选择开发计划来筛选:
●  硅油水平
●  橡胶配方,包括是否硅化、有无涂层以及涂层性质
●  顶空:有无顶空、气体覆盖
●  容器尺寸(尽量减少顶空)
●  预期储存条件,包括极端条件和运输模拟
●  潜在的目测检查极端条件,如高压泄漏检测、高强度光照和旋转
选择可靠的组件供应商,从而能够保证长期不会被迫更换配件。

3. 预充式注射器的特殊注意事项
由于硅胶是预充式注射器的生产中的必须成分但是硅胶会带来很多问题,因此在可能情况下采取步骤将其风险降至最低。使用硅含量极低的注射器。或者考虑交联(或固定)硅油,这是一种相对较新的技术:在注射器内涂抹硅油后,利用光将硅油粘合到玻璃针筒壁上,从而将硅油聚合成网状物。该处理将硅油更紧密地粘附到注射器筒壁上,不太可能被拉进生物溶液中。此外,由于该工艺使用的硅油比传统硅油润滑剂少100倍,因此硅油-蛋白质相互作用的风险本身就会降低。


钨也是一种强大的稳定破环物质。目前市场上有无钨注射器或少钨预充式注射器。
是否使用交联硅油和/或无钨注射器主要取决于您的蛋白质结构承受压力的能力。如果您的生物制剂的硅油含量很低或对氧气不太敏感,使用标准预充式注射器的风险可能较低。
 
通过【配方】来预防蛋白质聚集

生物制剂失败的主要原因通常是配方有缺陷。产品从开始生产到效期结束持续面临着时间及其它影响因素带来的挑战,稳健的配方是蛋白质抵御这些挑战的第一道防线。
您可以采取其他预防措施,如温和的混合过程、低光照和 pH 控制,但如果不能“满足”蛋白质的需求,它最终仍会聚集并破坏配方的稳定性。


筛选正确的配方是一项复杂的工作。
大多数生物制剂包含几种常用组份(即“辅料”),如表面活性剂、糖或盐;或其它改善溶液性质(如pH、粘度或张力)的物质。例如,药物配方中可能添加如盐酸胍或尿素类的辅料以促进不溶性蛋白的溶解。但是,这类化学物质也是触发蛋白质聚集的有力因素。在许多情况下,如何寻找到一个平衡成为优化配方成分的挑战。
以下我们拆分开生物制剂的主要成分,逐一来解决。

表面活性剂
基于蛋白质特性引入适合的表面活性剂。表面活性剂可以包裹蛋白质,防止蛋白质之间直接接触(相互作用)。如果您的蛋白折叠不良,例如容易发生聚集,加入表面活性剂能够减少聚集。表面活性剂也有助于您的蛋白质亚基的溶解度。


表面活性剂具有疏水性和亲水性。疏水基结合到蛋白质上的疏水端上,防止蛋白质彼此结合(聚集)。同时,表面活性剂的亲水基暴露于溶液中,有助于蛋白质的溶解。表面活性剂也可防止蛋白质吸附到工艺表面(玻璃、不锈钢、管线、袋)和容器中。


然而,您必须适量添加。
因为太多表面活性剂会有导致蛋白变性的风险。 过量表面活性剂可以进入您的蛋白质内部并强迫其展开而引起聚集。过多表面活性剂也可能在混合过程中产生过多泡沫。蛋白质倾向于迁移至泡沫中,并在其中展开和聚集。


如果表面活性剂太少,会失去保护作用。生产工艺期间,某些组份可能吸附于管道、滤膜或其他表面。如果您添加的表面活性剂太少,然后被吸附,您可能只剩下一小部分表面活性剂来保护您的蛋白质。


配方中添加糖类可为您的蛋白质提供合适的水合环境。糖还可以帮助保持您的蛋白质适当折叠,保持其三级和四级结构的功能和溶解性。


可能需要在您的制剂中添加盐,以保持蛋白质的功能和有效性,或提高制剂张力给蛋白提供一个稳定的环境。
盐可起到稳定或去稳定作用;它们为蛋白质建立静电键,以保持蛋白质折叠或解折叠。一些盐(或相同盐的不同含量)可以促使蛋白质形成更稳定的结构,称为“盐溶”。另一部分盐则起到相反的作用:电荷较大(电荷密度较大)的盐可与蛋白质表面的异种电荷相互作用,破坏保持蛋白质内聚的氢键网络。如果电荷密度足够大,可将蛋白质拉开-“盐析”-并产生自聚集/沉淀。

粘度调节剂
高度浓缩的蛋白质溶液变得越来越流行,部分原因是它们能够以更小剂量给予,同时还可能提供更方便的给药选择。然而,这些稠密、粘稠的溶液对容器中的蛋白质结构施加了压力。在这种密切接触中,它们更容易相互影响,并与辅料或容器相互作用,从而引起聚集。在生产和储存期间,其也更可能受到剪应力的影响。总之,这些效应可能影响产品的稳定性、安全性和有效性。
粘度调节剂通常是一种特定类型的氨基酸或盐组合,通过破坏分子间的相互作用来保护您的蛋白质,其作用类似于表面活性剂。

缓冲液
缓冲液的选择对配方来说至关重要。
缓冲液必须在药物有效期内提供稳定的 pH 值,以确保您的药物保持在质量标准范围内,包括防止随时间推移发生蛋白水解或脱酰胺。缓冲液还可防止玻璃分层和容器内颗粒物形成。

顶空
必须正确处理顶空的存在,以随时间推移保护药物。如果您的药物对氧气敏感,在未充氮气环境下灌装,顶空可能导致药物氧化。顶空也会增加运输过程中与剧烈液体移动相关的剪应力。应该认真选择正确的容器尺寸以确保西林瓶或注射器灌装后顶空最小。


总之,您可以采取多种途径来降低无菌注射剂中的蛋白质聚集风险。通过应用具有实用性的、经过检验的方法,您可以开发出一种安全有效的生物制剂来满足迫切等待的患者的需要。


来源:荣格-《国际医药商情》


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