mRNA 疫苗与免疫治疗的临床进展（上）

两种基于 mRNA 的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）疫苗，自病毒序列公布到FDA批准紧急授权使用（EUA）仅用时约11个月，这凸显了这种核酸技术的变革潜力。迄今为止，大多数 mRNA 的临床应用主要集中在传染病和癌症疫苗上。这主要由于某些mRNA种类和剂型的固有免疫特征，只需低剂量、低表达水平、局部递送就足以起效。此外，mRNA 编码蛋白或细胞免疫疗法的工作也已开始，为此，最低限度的免疫刺激、靶细胞和组织中的高蛋白表达，以及反复的给药需求，对其临床转化带来新的生产和剂型挑战。在这一势头的基础上，过去一年在COVID-19疫苗、Omicron 特异性增强剂和季节性流感、 EB病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）和癌症疫苗方面取得了临床进展。本文回顾了 mRNA 治疗的临床进展，并提供了这些基于 mRNA 的药物背后的转化技术的概述和未来展望。

2019冠状病毒毒疾病的两种快速应答 mRNA 疫苗： Comirnity （BNT162b2）和 Spikevax （mRNA-1273）的完全批准，最终实现了 mRNA 的医学应用前景。2020年3月16日，在2020年1月11日公布病毒序列后的几周内，莫德纳的mRNA-1273【针对SARS-CoV-2 spike（s）蛋白的几种mRNA疫苗之一】首次给人类志愿者注射。近十年来用于传染病和癌症的 mRNA 疫苗的临床经验促进了这一显著的成就。

图1：2020 年时间表显示了针对 sars-cov-2 的 mRNA 疫苗的快速发展

利用 mRNA 编码蛋白质用于疫苗接种或蛋白质替代的概念在1990年首次得到了活体内的确证，当时 Wolff 等研究者在小鼠肌肉注射后证实了目标蛋白的产生。然而，这项技术的前景经过了几十年才得到临床验证，这种滞后部分源于mRNA稳定性、递送的技术难题，还有研究热度的冷却，自2000年起，更多的资助和产业界兴趣开始转向DNA疫苗。与此同时，mRNA 作为疫苗部分的潜在优势，如设计和测试的便捷性和速度、固有的免疫原性、快速扩增和制造以及插入突变的可忽略风险等，令少数专门的学者继续研究这种单链核酸。

mRNA 技术的一个特别重要的优势来自于它作为蛋白质翻译模板的生物学作用。传统的疫苗技术依赖于在生物反应器或鸡蛋中使用哺乳动物细胞批量生产疫苗，而 mRNA 疫苗只有在病人细胞内才能成为最终产品。实际上，mRNA 使用人体作为自己的疫苗生产设施，有几个伴随的优势。

首先，mRNA允许人体翻译后修饰（PTM）的蛋白质产品的潜在免疫原性和全部功能。其次，不适合在生物反应器中产生的多聚体蛋白质可以在患者的细胞中被正确翻译、折叠和组装（例如，Moderna 为研究性巨细胞病毒【CMV】疫苗【mRNA-1647】设计了五种mRNA混合物，产生五聚体蛋白）。再次，mRNA 治疗可以产生贯穿细胞膜和细胞内的蛋白质，并将它们运送到细胞环境中的适当位置。

与基于病毒载体的模式相比，mRNA 也降低了预先存在的针对载体的抗体（这限制了可用于治疗的患者群）或产生剂量后抗体的可能性，从而降低了后续剂量的疗效。虽然在临床前的模型中已经观察到 RNA 纳米制剂的抗载体抗体的产生，但是已经开发出消除这些反应的方法，使重复给药不会降低疗效。还有成功的重复人体给药和反复的人体给药相关的短干扰 RNA 纳米制剂的例子。

与其他药物类似，mRNA 的剂量可以根据患者的需要、体重和疾病状态，而调整剂量，间隔时间可以更长或更短。此外，作用的持续时间本质上是有限的，减少了不可逆的副作用的可能性，使急性适应症的治疗成为可能；由于 mRNA 降解受正常细胞过程的调节，活体内的半衰期可以通过修改分子和还原剂的递送方法来调节。

图2： mRNA 递送纳米颗粒的组成

下文综述提供了有关mRNA药物的临床应用及进展，特别强调制造和配方等方面的技术创新，这些创新已经将这种方法从设想转变为批准的疫苗，从迄今为止的临床试验中吸取的经验教训，以及我们为未来研究设想的挑战，包括其他模式的前景，如 mRNA 编码的蛋白质和细胞免疫疗法。

mRNA作为医疗产品

mRNA药物可以分成三类：预防性疫苗、治疗性疫苗及蛋白编码疗法。尽管每种应用都有各自挑战，但一个共同点在于如何将mRNA递送到目的细胞并保持mRNA的稳定性。RNA分子原本就不稳定，所以早期概念验证阶段的重点就是提高稳定性。不同技术包括优化5’端帽子结构、3’端poly（A）尾的长度、及5’和3’非编码区的调节元件等。

除了在改善mRNA稳定性方面取得的这些进展外，有效的体内mRNA药物还需要有效的细胞内递送。十年间，研究者先后尝试过裸mRNA、纳米颗粒包裹，如今更多使用脂质载体递送。典型的脂质纳米载体（LNP）剂型包含如下组成：1、一个可与多聚负电荷的RNA互作的阴离子或阳离子脂分子层；2、个辅助磷脂分子（如DSPC），用于模拟细胞膜中的脂质成分并支持形成双层结构；3、一种胆固醇类似物，用于调节脂双层的流动性；4、聚乙二醇-脂质，用于提高胶束稳定性并降低调理作用（图2）。

尽管在临床上远不如 LNP先进，聚合物纳米粒子（PNP）也显示出作为输送系统的前景。这些制剂通常由可生物降解的含胺聚合物组成，可以与 RNA 自组装。根据应用，PNPs也可以用辅助磷脂，胆固醇和 PEG 脂质配制（图2）。LNP 和 PNP都可以用特定的配体进一步修饰以促进细胞特异性靶向目标命中。目前正在开发的非病毒载体制剂的特异性组成差异很大，可能对纳米颗粒-mRNA 复合物的细胞递送效率、靶向细胞类型以及给药的 mRNA 药物的免疫原性产生重大影响。

在需要的时候引发适当的免疫原性（疫苗）或在其他适应症（mRNA 蛋白替代疗法）中逃避免疫原性是制造和配制 mRNA 药物时需要考虑的一个重要方面。RNA作为 RNA 病毒的遗传物质或 DNA病毒复制的副产品，可以对先天免疫系统产生强烈的刺激作用。微生物 RNA 具有许多结构和序列特征，这些特征与宿主细胞中的模式识别受体可以识别的自身 RNA 不同。主要有两类模式识别受体通过与其匹配的天然免疫反应产生I型干扰素（IFN）和炎症细胞因子：一类是Toll样受体（TLR），位于表皮细胞和DC、单核、巨噬等免疫细胞的细胞膜、内体和溶酶体；另一类是视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体，位于大多数细胞的胞浆中。TLR3被双链RNA（dsRNA）激活，而TLR7和TLR8则被单链RNA激活。RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）分别被胞浆中5’磷酸化的短dsRNA（18-19bp）和长dsRNA（＞1000bp）激活。TLR3激活导致IFN-I的产生，是通过TICAM-1通路；而其他TLRs利用MYD88依赖的级联反应诱导转录因子NF-κB依赖或IRF3依赖的的炎性细胞因子前体的产生。这些途径被mRNA产物及其传递载体激活的程度，在一定程度上决定了一款mRNA产品的应用和发展前景。

mRNA 在生物医学的应用领域继续迅速发展。下文的讨论分为三个领域： 直接活体内注射用于传染病预防性疫苗的 mRNA（本期） ，治疗性癌症的 mRNA 疫苗和 mRNA 编码的免疫疗法。

传染病疫苗

在美国食品和药物管理局（FDA）批准COVID-19疫苗后，mRNA现在被认为是传染病中潜在的转化疫苗形式，针对SARS-CoV-2以外病原体的mRNA疫苗的进一步验证十分迫切。

mRNA分子固有的免疫刺激性质和作为免疫佐剂的功能被视为疫苗应用的关键优势，但将这些特性转化为一种安全有效的临床产品面临着平衡免疫刺激与编码抗原表达之间的挑战。迄今为止，临床上最先进的产品是具有化学修饰和未修饰核苷酸碱基的非复制性mRNA疫苗。辉瑞生物科技公司的BNT162b2和莫德纳的mRNA-1273这两种经批准的mRNA产品，是含有化学修饰的尿嘧啶碱基的疫苗。

相比之下，迄今为止，针对COVID-19的未修饰RNA疫苗试验的结果令人失望。尽管最终数据仍有待公布，但CureVac报告称，其未经修饰的CureVac 2019冠状病毒疾病疫苗（CVnCOV）对冠状病毒感染的保护率仅为47%。对于未经修饰的CureVac疫苗与经修饰的疫苗相比的效力较低，学者提出了各种解释。CureVac在试验过程中提出SARS-CoV-2变异情况的变化，而BNT162b2或mRNA-1273的情况并非如此；其他学者注意到，与BNT162b2（30µg）和mRNA-1273（100µg）相比，CureVac使用较低剂量（12µg）（选择为未修饰RNA比修饰RNA更具反应性）可能不足以产生有效的中和抗体反应；另有学者假设，未修饰RNA的翻译效率可能较低，导致表位水平较低。­­­

除了上述非复制性mRNA疫苗外，还有几个研究小组也在研究编码RNA依赖性RNA聚合酶的自我扩增结构，这些RNA依赖性RNA聚合酶可以扩增传递的RNA，从而增加抗原蛋白表达。到目前为止，这些药物只完成了早期临床试验。最后一种疫苗的一个潜在缺点是任何mRNA递送技术都必须应对与自我复制mRNA疫苗相关的显着更大的mRNA构建体大小。

与重组蛋白疫苗类似，上述所有mRNA疫苗都具有不产生传染性颗粒的优点。因此，与减毒活病毒疫苗或具有复制能力的病毒载体相关的担忧及其恢复为致病形式或导致某种形式的加重疾病的可能性（如在呼吸道合胞病毒（RSV）减毒活疫苗中观察到的）不适用。与DNA疫苗或某些病毒载体相比，mRNA疫苗的另一个主要优点是没有因整合到受体DNA中而导致插入突变的风险。

加速发现和开发时间

SARS-CoV-2大流行在全球的迅速传播突出了能够快速部署用于人体试验的疫苗技术的重要性。mRNA疫苗的发展速度如此之快，以至于在非人灵长类动物的研究证实通过感染SARS-CoV-2或通过DNA疫苗可以实现保护性免疫之前，首批产品已经进入临床试验。­­

图1所示的时间顺序说明了mRNA公司以前所未有的速度转向生产SARS-CoV-2候选疫苗。辉瑞－BioNtech和莫德纳两项独立工作的时间线非常相似，表明监管机构从病原体的基因鉴定到EUA的发展轨迹，比典型的疫苗开发时间短11个月或几年。

其他mRNA公司也能够以相对快速的方式利用其先前在疫苗开发方面的专业知识。例如，CureVac宣布批准于2020年6月开始CVnCOV的I期临床研究（NCT04449276），并于一年后获得其第II-III试验的中期结果（HERALD，NCT04652102）；2020年11月9日，Arcturus宣布了ARCT-021（NCT04480957）I期研究的中期结果；Sanofi Pasteur–Translate Bio（NCT04798027）、伦敦帝国理工学院（ISRCTN17072692、Eudract 2020-001646-20）和云南沃森生物（ChiCTR2000034112）都在SARS-CoV-2序列公布后不到一年的时间内将mRNA疫苗用于人体试验。­

COVID-19大流行挑战了疫苗开发的传统方法，并为促进mRNA疫苗研究创造了独特的环境。一个关键的区别是公司从生物医学高级研究与发展局和防疫创新联盟获得的大量注资。突发公共卫生事件推动了开发工作的快速发展，并促使制造商找到缩短临床时间的方法（例如，通过并行化系列开发过程的不同部分，尽量减少试点研究和进行最低限度的产品质量发布测试）；相反，针对已建立疫苗的新mRNA技术的广泛验证（正如之前在mRNA疫苗CV7202与灭活菌株疫苗Rabipur的并行评估中所做的那样）被取消了优先级。

制造和放大

mRNA（和某些类型的DNA）疫苗的许多优点与制造的速度和灵活性有关，而制造的速度和灵活性在很大程度上取决于含有化学成分的体外过程。由于mRNA编码相关免疫原性蛋白，不需要活病毒，因此不需要专门的设施或生物安全实验室。与以鸡胚为基础的疫苗相比，mRNA疫苗不受鸡胚生产能力的限制，允许对鸡蛋过敏的个人进行疫苗接种。在无细胞系统中生产可将细菌污染的风险降至最低，无需生物反应器工艺。

所有基于核酸的疫苗（无论是mRNA还是DNA）都编码感兴趣的免疫原，但其特性独立于该免疫原。具有mRNA平台的不同疫苗的制造依赖于相同的化学成分，这意味着，一旦对该平台进行了投资，就可以很容易地适应新的病原体。在为新出现的流行病或季节性疫苗做好准备的情况下，这是一个特别有吸引力的特点。­

此外，相同的制造工艺可用于疫苗和其他基于mRNA的药物，提供了效率和灵活性。鉴于在第一代疫苗推出的同时出现了新的SARS-CoV-2株，这种在同一运载工具中切换编码mRNA的灵活性尤其有用。尽管对制造成本没有达成共识，但预计该技术比旧方法更具成本效益。

快速抗原特异性序列优化

mRNA技术的另一个优势是能够在引入核酸变化的基础上设计和重新设计抗原，与不同蛋白质或肽的生物工程相比，这是一个相对简单的过程。对新冠疫苗而言，则主要是以引入脯氨酸的形式将免疫原性S蛋白稳定在融合前结构中。

BioNTech应用了这种技术灵活性，将不少于5种不同的COVID-19 mRNA疫苗候选疫苗投入临床（三种使用核苷修饰的mRNA，一种使用含尿苷的mRNA，一种使用自扩增mRNA）。BNT162b1候选疫苗使用核苷修饰的mRNA编码SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域，为增强免疫原性引入一个T4纤维蛋白来源的三聚体折叠结构域。最终选定的候选基因BNT162b2编码由两个脯氨酸取代修饰的全长S蛋白，以将其锁定在融合前构象中。来自CureVac29、47、Moderna48和Translate Bio49的其他COVID-19 mRNA疫苗也使用经过各种修饰的S蛋白。

目前正在开发的几种疫苗至少经历了一个迭代优化步骤是mRNA产品开发的特点。例如，针对RSV的mRNA-1777在一期试验中进行了测试，临时数据显示，单次给药后通过中和抗体水平测定的体液免疫反应。然而，这种药物的开发已经暂停，转而支持mRNA-1172，在动物模型中，它被证明比mRNA-1777更有效。类似地，寨卡病毒疫苗候选基因mRNA-1325（NCT03014089）的开发也被暂停，取而代之的是mRNA-1893，该基因使用了不同的序列，据报道在非人灵长类动物研究中的效力是mRNA-1325的20倍。截至2020年2月，90名黄病毒血清阳性和血清阴性的参与者接受了mRNA-1893或安慰剂的给药方案，两次给药间隔1个月，剂量分别为10、30和100µg（NCT04064905）。

编码多种蛋白和/或蛋白亚基

新冠病毒S蛋白免疫原是同源三聚体，因此只需引入单个mRNA序列。对于主要免疫原由多个亚单位组成的病原体，生产重组蛋白亚单位并以正确的化学计量将其成功重组为完整蛋白质的挑战很容易想象。相比之下，mRNA很容易用于此应用。单独的亚单位可以编码在单个长mRNA中，也可以作为单独的mRNA链。例如，针对CMV的疫苗mRNA-1647包含六种mRNA，其中五种编码五种不同的蛋白质，结合形成五聚体蛋白质，第六种编码CMV糖蛋白B（gB）蛋白质。在一种相关的方法中，单一疫苗可以针对两种不同的病原体，如mRNA-1653，它结合了两种mRNA，针对人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒3型（PIV3）的F蛋白。

调节 mRNA 免疫原性

除了反复优化序列以优化抗原的免疫原性外，还可以利用完整mRNA转录本本身和其制造过程中产生的其他RNA产物的固有免疫原性来增强对mRNA疫苗的免疫应答。RNA的先天潜在免疫原性在疫苗接种中可能是有利的，因为它可以激活免疫反应途径，如TLR系统，从而导致DC成熟，随后产生强大的B和T细胞免疫反应。如前所述，CureVac的CVnCoV具有未经修改的mRNA。然而，这种RNA驱动的免疫抑制也可能是有害的，导致临床副作用以及相关蛋白的表达减少。例如，RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）的激活与翻译抑制有关。

近年来，在体调节mRNA免疫原性已经取得一些进展，最主要的方法是用化学修饰替换非修饰核苷酸。某些核苷酸修饰，如假尿嘧啶和5’-甲基胞嘧啶，可以显著降低TLR信号和PKR活化，增加蛋白在小鼠中的表达量。前述两种新冠mRNA疫苗都使用N1-甲基假尿嘧啶替换尿嘧啶。但也有研究显示，相较于带有修饰碱基的mRNA，未修饰的构建在Hela细胞及小鼠肝脏中的蛋白表达量更高。作者推测mRNA纯化方法的改进和杂质RNA的去除或许可以部分解释上述报道中的差异。使用凝胶柱纯化祛除dsRNA或新近出现的更廉价的膜结合技术均可显著提高翻译效率。CureVac的研究人员报道经HPLC纯化、序列优化、含有非修饰碱基的mRNA无免疫原性并可在小鼠体内表达更多的目的蛋白。近期，Genetech的科学家报道白介素（IL）-1β和IL-1受体激动剂（IL-1RA）是调节mRNA系统响应的关键调节子，这提示可能是小鼠、非人灵长类、人体中这类调节元素的差异导致研究结果不同。（未完）

作者：Ann J. Barbier，Allen Yujie Jiang，Peng Zhang，Richard Wooster，Daniel G. Anderson
期刊：Nature Biotechnology, volume 40, pages 840–854 '2022'
翻译：John Xie

来源：荣格-《国际医药商情》

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