细胞培养中的污染类型及其防控策略

细胞培养作为生命科学研究中的核心技术，其应用已从最初的试管中培养蛙神经纤维，发展到如今涵盖基因工程、药物开发和疫苗生产等多个领域。然而，即使技术不断进步，细胞培养面临的主要障碍仍然是污染问题。培养细胞所需的营养丰富环境同样也是各种污染物繁殖的理想场所。与体内有免疫系统保护的细胞不同，培养瓶中的细胞缺乏免疫反应，更容易受到机会性病原体的侵袭。

 

污染会显著影响细胞生长，改变细胞形态，增加死亡率，进而影响实验结果和数据可靠性。本文将深入探讨细胞培养中常见的污染类型，如何尽早识别和处理污染，以及如何彻底预防污染，确保细胞健康生长。

 

 

 

Part 1

细胞培养污染的主要类型

 

支原体污染

 

支原体是细胞培养实验室中最常见且最难发现的污染源之一，因为它们在标准光学显微镜下不可见。支原体是微小的原核生物，缺乏细胞壁，仅表达约 800 kbp 的微小基因组，相比之下，细菌的平均基因组大小为 5 mbp。尽管有这些差异，支原体被认为是从革兰氏阳性菌退化演变而来，并保留了独立于其他细胞复制的能力。

 

细胞培养中最常见的支原体种类包括发酵支原体（Mycoplasma fermentans）、口腔支原体（Mycoplasma orale）和精氨酸支原体（Mycoplasma arginine）。污染源通常来自动物源性试剂和操作人员交叉污染，甚至是实验室人员自身。大规模筛查表明，15-35% 的连续细胞系都受到支原体感染，而细胞系在实验室之间的频繁传递为其传播提供了充分机会。

 

虽然支原体污染在受感染的培养物中不会产生任何可见或形态学症状，但它可以对细胞功能产生深远影响，包括基因表达、蛋白质合成与分泌以及代谢的改变。这反过来会显著影响使用受污染细胞进行实验所产生数据的质量和可靠性，甚至改变癌细胞系对化疗的反应。

 

即使识别出支原体污染，也极难根除：由于缺乏细胞壁，支原体对许多标准组织培养抗生素不敏感；而其微小尺寸又使其能通过大多数过滤器。因此，最好定期进行污染筛查，特别是当新细胞系引入实验室时。

 

 

细菌污染

 

细菌污染是另一种常见的细胞培养污染类型。由于细菌在大多数环境中普遍存在，它们很容易通过不良的无菌技术或用于加热培养基的被污染水浴引入培养物中。常见的细菌污染物包括大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、肠球菌（Enterococcus malodoratus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis），它们都是环境中常见或正常人类微生物群的组成部分。

 

细菌污染物能在有利的组织培养基环境中迅速繁殖，通常可通过培养基的视觉变化轻易识别。大量细菌会导致培养基pH值下降，含酚红指示剂的粉红色培养基会变成黄色。如果污染细菌是需氧的，还会使培养基变浑浊，这与正常的非贴壁细胞的外观不同。

 

 

真菌污染

 

由于真菌在环境中的普遍存在和以孢子形式长期存活的能力，使用不良无菌技术处理的细胞培养物容易被真菌污染。#真菌污染 通常由霉菌或酵母引起。

 

#酵母污染：酵母是通过出芽繁殖的单细胞真核生物。大多数酵母的复制速度快于微生物细胞，因此它们能迅速与细胞培养物竞争营养丰富的环境。初始污染通常不会引起颜色变化，但重度污染会使培养基变浑浊。它们在培养中表现为椭圆形生物，通常比培养细胞小，可通过其「出芽」繁殖方式识别，这种方式形成细胞链。最常见的酵母污染来自念珠菌属（Candida）。

 

#霉菌污染：与单细胞生物污染不同，霉菌污染在后期阶段非常明显。霉菌如常见污染物曲霉菌（Aspergillus）和青霉菌（Penicillium），是产生长丝状菌丝和大型菌落的多细胞生物。在污染早期，它们可能表现为白色、黄色或黑色的模糊点，随后发展成漂浮在培养基中或附着在培养瓶侧面的毛茸茸的大片。真菌孢子能长期存活，几乎无处不在。它们通常通过空气传播感染培养物，污染几率会随季节变化，因为空调或暖气的增加使用或空气中花粉含量高会增加霉菌污染的可能性。

 

 

病毒污染

 

#病毒污染 是最难检测的污染类型之一，因为病毒是必需的细胞内生物，在光学显微镜下不可见。虽然一些病毒污染物如疱疹病毒和腺病毒会导致可见的细胞死亡，但其他（如逆转录病毒）则是无声的污染物，它们建立慢性感染而不影响细胞生长，如果没有针对已知物种的特定基因分析或电子显微镜，极难识别。

 

与其他类型的污染（通常来自环境或操作人员）不同，病毒污染往往源于细胞系本身。例如，20 世纪 50 年代和 60 年代，从恒河猴分离用于脊髓灰质炎疫苗的肾细胞后来被发现受到猿猴病毒 40（SV40）的污染。在某些情况下，被人类或人畜共患病毒如人类免疫缺陷病毒（HIV-1）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）污染的细胞可能使科学家面临感染风险，需要比未受污染细胞更高的生物安全级别。

 

 

其他类型的污染

 

除了细菌、真菌、支原体和病毒外，还存在其他类型的细胞培养污染，包括寄生虫、朊病毒、化学污染和来自其他细胞系的交叉污染。

 

#寄生虫污染

 

来源：原代培养物中可能发现细胞内寄生原虫，包括弓形虫（Toxoplasma gondii）、隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和疟原虫（Plasmodium）。

检测：细胞内寄生虫的视觉检测因寄生虫而异，但可通过 PCR 等测试确认疑似污染。

预防：高风险原代细胞培养物在使用前应进行寄生虫污染测试，并使用适当的防护方法处理此类细胞系，避免实验室获得性感染。

 

#朊病毒污染

 

来源：某些细胞系可能易感朊病毒感染，这可能源于胎牛血清（FBS）补充剂。

检测：朊病毒无法通过视觉检查培养物检测，但应测试有风险的试剂。

预防：使用低朊病毒风险的高质量培养基补充剂，并定期测试试剂批次。

 

#化学污染

 

来源：包括来自塑料器皿或试剂的洗涤剂、激素、重金属和增塑剂。内毒素可从细胞培养基和补充剂引入。某些培养条件如强荧光照射可诱导自由基。

检测：难以观察，但会抑制生长和复制。

预防：确保水和试剂经过重金属污染测试；只使用可靠来源的、经认证低内毒素水平的培养基和补充剂；可向培养基添加维生素 A 或 E 等自由基清除剂。

 

#种内和种间交叉污染

 

来源：来自同一物种或另一物种的不相关细胞系。

检测：具有不熟悉或不同形态或意外特征的细胞过度生长。常规测试也可检测污染。

预防：任何新细胞系进入实验室时都必须进行表征，现有细胞系应定期测试，因为交叉污染可能导致不可靠和不可重复的发现。测试可通过基因测序或同工酶分析进行。

 

 

 

Part 3

如何识别细胞培养中的污染

 

在了解污染外观之前，需要知道健康培养中细胞应有的样子。形态、贴壁性、培养基浑浊度和颜色的变化可能是污染的警示信号，有助于决定测试、处理和监测的最佳方案。此外，了解污染源可能的来源有助于在问题发生前预防。寻找污染模式可以帮助识别微生物的潜在来源，如脏水浴、新试剂或无菌技术失误。

 

常见污染物的来源与检测

 

支原体

 

来源：动物源性试剂和操作人员交叉污染。

检测：结合常规细胞系测试，观察细胞生长率或形态变化。

处理/预防：受感染的细胞系应丢弃，实验室消毒。对不可替代的细胞可使用特异性抗支原体抗生素。所有进入实验室的新细胞系应隔离并使用市售测试试剂盒进行测试。

 

细菌

 

来源：不良无菌技术、在受污染水浴中加热的试剂和操作人员交叉污染。

检测：培养基视觉变化（如颜色变化或浑浊）或细胞生长变化。在显微镜下可能看到运动的细菌细胞。可使用微生物培养技术或 PCR 确认污染。

处理/预防：受感染的细胞系应丢弃，实验室消毒。对不可替代的细胞可使用抗生素。无菌技术是最佳预防方法。

 

真菌

 

来源：不良无菌技术、在受污染水浴中加热的试剂和操作人员交叉污染。

检测：霉菌易于视觉识别，表现为培养基中的毛茸茸斑块。酵母污染可能导致培养基浑浊，在显微镜下可见出芽链。

处理/预防：受感染的细胞系应丢弃，实验室消毒。对不可替代的细胞可使用抗真菌药物。无菌技术是最佳预防方法。

 

病毒

 

来源：原代细胞培养物，从其他细胞系水平传播。

检测：某些细胞病变病毒可能导致细胞死亡，而其他物种只能通过电子显微镜识别。可通过基于细胞或PCR的测定确认污染。

处理/预防：受感染的细胞系应丢弃，实验室消毒。应评估安全协议以防止实验室获得性感染。新的高风险细胞系应隔离并测试。

 

 

Part 3

如何去除细胞培养污染

 

最佳措施是立即处理任何受污染的培养物，并消毒可能与受污染培养物接触的所有物品，包括水浴、培养箱、层流罩或II级生物安全柜。根据污染源，可能还需要测试或处理试剂，或重新培训工作人员。

 

然而，在某些情况下，处理细胞系可能不可行。如果不可替代的细胞系受到污染，可以尝试消除或控制污染物，前提是它是细菌、真菌或支原体。

 

首先要确定污染物类型：是细菌、支原体、真菌还是病毒？支原体、细菌和真菌的金标准是培养，但这可能需要几天时间，而控制污染需要更快的方法。因此，可以使用 PCR、DNA 染色或测序等更快的方法。市售支原体测试试剂盒也随时可用。

 

以下是处理受污染细胞培养的步骤——

 

1. 隔离受污染的培养物并彻底清洁实验室，使用适当的消毒剂。

2. 某些处理可能对细胞有毒，可能需要进行剂量反应测试。可以收集受污染的细胞悬液，以标准稀释度接种到新鲜的平板或瓶中，然后添加不同浓度的适当抗生素或抗真菌药物。应观察细胞几天，寻找毒性迹象（如生长不良、脱落和变圆）。

3. 确定潜在毒性后，可将细胞系在含适当浓度抗菌剂的培养基中培养 2-3 代。

4. 在无抗生素培养基中培养细胞一代，然后再在处理过的培养基中培养 2-3 代。

5. 在无抗生素培养基中培养细胞几代，确定污染是否已清除。如果仍显示污染迹象，重复步骤 4-5。

 

 

Part 4

何时及如何使用细胞培养抗生素

 

抗生素可用作治疗以清除细菌或支原体污染，但许多实验室也将其作为标准培养基中的预防措施。青霉素和链霉素等抗生素混合物在使用前添加到培养基中，以防止细菌污染。预防性抗生素在某些情况下可能有用（如原代细胞培养、关键实验或选择基因修饰细胞）。然而，过度使用或误用抗生素可能产生不良影响。

 

抗生素的持续存在可能创造一种虚假的安全感，导致忽视良好无菌技术的实施。一项主要研究发现，持续使用抗生素培养的细胞培养物比不使用抗生素培养的细胞培养物有十倍多的支原体污染。此外，持续使用抗生素可能导致缓慢生长的抗生素耐药生物污染，这些生物对细胞行为造成微妙变化，但难以识别或消除。

 

长期在细胞培养中使用抗生素也会影响细胞本身。研究表明，青霉素和链霉素的抗生素处理可影响基因表达，潜在改变细胞分化和蛋白质去磷酸化等细胞行为，而利福平可诱导全基因组变化。因此，应仔细考虑细胞培养中长期使用抗生素的副作用，特别是在敏感研究中，良好的无菌技术可取得相同结果。

 

 

Part 5

如何避免细胞培养污染

 

虽然某些形式的污染有可用的处理方法，但这可能很耗时，并对之前使用同一细胞系进行的实验所收集的数据提出质疑。高度污染的细胞系可能必须处理掉，以防止传播到实验室中的其他细胞系。如果库存细胞系被污染，所有受感染的库存可能需要销毁。因此，在几乎所有情况下，预防确实比治疗更好。

 

预防污染有几种途径，这些应在新细胞系一到达实验室就启动。新细胞系是最常见的污染源之一，所有新细胞系都应在单独的实验室或II级生物安全柜中隔离，并在引入一般实验室前测试常见污染物如细菌和支原体。如有可能，细胞系也应进行测试以确认其身份。一旦细胞系在实验室建立，应定期进行质量控制，包括常规污染测试。任何动物源性试剂如FBS在使用前应进行处理，例如紫外线照射。

 

许多实验室在标准细胞培养基中使用青霉素和链霉素等抗生素混合物，尽管这些可能产生负面影响。总的来说，预防细胞培养污染的最佳方法是拥有训练有素的工作人员，遵循良好的无菌技术，在干净、维护良好的实验室中工作。

 

自方法早期以来，细胞培养中对无菌技术的需求就已经很明显。哈里森的研究曾因反复的细菌污染而受到挑战，直到他采用了无菌技术。

 

良好的无菌技术和正确使用认证的生物安全柜对高效、无污染的细胞培养实验室至关重要。此外，经过培训能在最早阶段发现污染的操作人员可以通过尽早处理污染来帮助控制微生物的传播。全面的清洁计划也是预防污染的重要因素，通过减少实验室中环境微生物的数量。

 

层流罩和生物安全柜在每次使用后都应消毒，例如使用乙醇和紫外线。用于加热培养基或解冻试剂的水浴应定期清洁和消毒，任何溢出物或废物都应消毒并适当处理。进入生物安全柜的任何设备都应用乙醇或其他适当消毒剂擦拭，细胞培养直接接触的所有物品都应是一次性和无菌的。

 

通过训练有素的工作人员、干净的实验室和常规污染监测，可以最小化污染风险，维持充满健康、无污染细胞培养的实验室。

 

 

参考资料：

Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber. Exp Biol Med. 1906;4(1):140-143.

Roth JS, Lee TD, Cheff DM, et al. Keeping it clean: the cell culture quality control experience at the national center for advancing translational sciences. SLAS Discov. 2020;25(5):491-497.

Barile MF, Hopps HE, Grabowski MW, et al. The identification and sources of mycoplasmas isolated from contaminated cell cultures. Ann New York Acad Sci. 1973;225(1):251-264.

Ryu AH, Eckalbar WL, Kreimer A, et al. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 2017;7(1).

 

来源：荣格医药商情

作者：John Xie