四种类过氧化物酶活性的DNA纳米酶构成压力传感器阵列

大家好，今天为大家分享一篇于2024年发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry的文献，题目为“Pressure Sensor Array Based on Four DNA-Nanoenzymes with Catalase-like Activity for Portable Multiple Detection of Foodborne Pathogens”。这篇文章报道了一种基于四个具有类过氧化氢酶活性的DNA纳米酶的压力传感器阵列，用于便携式多重检测食品中的病原体。该传感器阵列能够区分不同的细菌混合物，并实现定量检测，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的平均检测限分别为10²和10⁴ CFU/mL。本文的第一作者是Jingbo Jiao，通讯作者是Nan Wang、Xinjun Du和Shuo Wang。

背景介绍

由于食源性病原体对医疗系统和全球经济造成的更严重危害，食品安全引发了不可忽视的关注，提高了公众对这一问题的意识。据报道，全球每年约有6亿人患上食源性疾病，导致约952亿美元的生产力损失和150亿美元的治疗费用。食源性病原体广泛分布于食品供应链的各个环节，作为一种人畜共患的致病菌，可通过分泌相应毒素并在胃肠道定殖对消费者健康造成危害。根据世界卫生组织的报告，伤寒、腹泻、头晕、胃肠炎、腹痛以及严重病例（如灾难性肾功能衰竭和肾并发症）的症状可由31种食源性病原体引起，包括大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、产气荚膜梭菌等。然而，这些症状在细菌感染的早期阶段往往被忽视，这表明需要快速检测食品供应链中的病原体污染以保障公众健康和福祉。

目前，各种分析方法已被开发用于检测食源性病原体，为其预防和控制做出了显著贡献。然而，与经典的平板计数法和聚合酶链式反应（PCR）方法相比，近年来开发的方法（如免疫学检测方法、基于核酸的分子生物学方法、生物传感器等）在检测中特别是特异性、用户友好性、灵敏性和便利性方面展示了巨大的潜力。但是，这些方法的应用范围通常局限于单一分析物检测，而不是更适用于复杂样品的多重检测，尤其是在贫困地区。受“锁和钥匙”策略的启发，模拟动物视觉和嗅觉系统的传感器阵列因其多重检测和相似性识别的能力而日益受到关注。构建自多个传感单元的传感器阵列可与一类分析物（而非单一分析物）产生非特异性相互作用，从而获得用于分析物识别的相应响应模式。随后，通过主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）等机器学习算法处理响应模式，能够提取多变量数据的特征，从而实现多分析物的有效识别并获得独特的“指纹”。然而，基于传感单元的非特异性相互作用容易受到复杂环境的干扰，从而降低识别能力并影响准确性。因此，开发与病原体具有更强相互作用的传感单元具有重要意义。

幸运的是，随着纳米技术的发展，作为一种具有酶样活性的纳米材料，纳米酶为传感单元的合理设计开辟了新视野，并在传感检测、生物医学和安全预防方面进行了广泛探索。(其中，DNA纳米酶相较于传统无机材料基纳米酶具有以下优势：(1) DNA的参与使DNA纳米酶的合成方法简单、通用且精确可控； (2) DNA磷酸骨架的负电荷可有效增强纳米酶的活性和稳定性； (3) DNA中的丰富化学基团不仅提供了与分析物结合的位点，还可通过在其表面修饰各种单体使其功能化。基于此，功能单体的修饰可改变DNA纳米酶的电位，并增加识别分析物的结合位点数量，例如聚乙烯亚胺、4-巯基苯硼酸（MPBA）、β-巯基乙胺（MEA）和万古霉素，这可以大大优化传感单元的性能。更重要的是，具有多种酶样活性的DNA纳米酶可催化不同的底物（如H₂O₂、TMB和4-硝基酚）产生压力、比色和其他可通过便携设备检测的信号，从而为开发满足现场检测需求的新方法提供了可能性。

设计原理

在此，研究人员提出了一种基于四种功能化DNA纳米酶的压力传感器阵列，并通过便携式压力计实现了对食源性病原体的多重检测。具体而言，传感器阵列中使用的传感单元是四种DNA纳米酶 [DNA-银/铂纳米酶（DAg/PtN）、DNA-金/铂纳米酶（DAu/PtN）、DNA-铜/铂纳米酶（DCu/PtN）和DNA-铂纳米酶（DPtN）]，它们可催化H2O2产生O2以改变密封管内的压力。通过MPBA和MEA的优异功能化，四种功能化DNA纳米酶与九种细菌之间可以获得不同程度的非特异性相互作用，包括MPBA/MEA功能化DNA-Ag/Pt纳米酶（DAg/PtMMN）、DNA-Au/Pt纳米酶（DAu/PtMMN）、DNA-Cu/Pt纳米酶（DCu/PtMMN）和DNA-Pt纳米酶（DPtMMN），从而通过催化H2O2产生不同的压力响应模式。进一步通过对压力响应进行的PCA和HCA分析实现了对九种病原体的识别。更重要的是，开发的传感器阵列表现出良好的便携性、可接受的灵敏度和令人满意的识别性能，并通过对人工污染样品的检测验证了其可靠的准确性（自来水中100%，生牛肉中91.7%）。因此，本研究为食源性病原体的多重检测提供了一种有前景的选择，并为食品安全和环境监测贡献了一条新途径。

方案1 基于压力传感器阵列的多重检测示意图。

数据介绍

图1 DNA纳米酶与病原体相互作用的表征结果。

这四种功能化的DNA纳米酶通过zeta-电位分析、UV-Vis吸收光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行了表征。图2a1–a4的比较揭示了初步合成的四种DNA纳米酶呈负电荷，在MEA修饰后转变为正电荷，表明MEA成功地功能化，能够与带负电的病原体通过静电相互作用。不同DNA纳米酶的UV-Vis光谱仅显示出DNA在260 nm处的特征吸收峰（图2b1–b4），这可能是由于Pt的存在覆盖了其他元素的特征吸收峰。随后，功能化的DNA纳米酶与DNA纳米酶相比显示出轻微的位移，这可能归因于引入的MPBA和MEA的结合效应。FTIR用于表征DNA纳米酶的结构成分（图2c1–c4）。对于DNA纳米酶，530 cm^–1附近的峰可能源自金属配合物，1000–1200 cm^–1区域和3430 cm^–1的峰分别归因于DNA的糖-磷酸振动和O–H振动，1630 cm^–1的峰归因于DNA碱基对的酰胺基团，确认了核苷酸序列参与了DNA纳米酶的合成。进一步地，在功能化DNA纳米酶的光谱中，650 cm^–1和3250 cm–1附近的带被识别为MEA的C–S伸缩振动和N–H弯曲振动，1580 cm^–1、1260 cm^–1、1330 cm^–1、770 cm^–1和730 cm^–1的新峰可能分别对应于苯环伸缩振动、芳香振动、B–O伸缩振动、O–B–O或B–O–H弯曲振动。这些特征带表明MPBA和MEA成功地负载到不同的DNA纳米酶上。

图2 各DNA纳米酶的Zeta电位、光谱图和催化稳定性。

考虑到测试样本中存在多种细菌，进一步研究了开发的传感器阵列识别细菌混合物的能力。基于上述确定的最佳检测条件，采用了两种模式来模拟细菌共存情况，包括不同属的不同物种（金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌在不同的比例下，分别为 100:0、75:25、50:50、25:75 和 0:100）以及同一属内的不同物种（金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和表皮葡萄球菌在不同的比例下，分别为100:0:0、0:100:0、0:0:100、20:20:60、33:33:33、20:60:20和60:20:20）。图 3a 显示了金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌在不同比例下的不同压力响应模式，这些模式在热图（图 3c）中得到了更加直观的呈现。PCA分析表明，在经典得分图（图3b）中，混合物的数据簇位于纯金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的数据簇之间，并且没有重叠，能够清楚地区分开来。图 3d,f 显示了开发的传感器阵列对不同百分比的葡萄球菌混合物的不同压力响应模式。图 3e 中的二维 PCA 图表明，七组混合物能够被完美地区分，分类准确率为 100%。上述结果表明，开发的传感器阵列在复杂情况下具有显著的识别能力，从而促进其在实际应用中的推广。

图3 传感器阵列对细菌混合物的响应。

开发的传感器阵列的定量性能通过检测不同浓度的细菌进行评估。以大肠杆菌和志贺氏菌为例，雷达图显示了每种功能化 DNA 纳米酶对不同浓度的特定细菌具有令人满意的区分能力和多样化的响应（图4a,d）。PCA 表明，不仅可以强有力地将相同浓度的细菌聚集成簇，而且还可以很好地区分其他浓度的细菌（图4b,e）。此外，考虑到因子1随细菌浓度的增加而增加，并且大于95%，因此在二维散点图中使用因子1来描述不同浓度下细菌的聚集情况。图4c显示了大肠杆菌在 OD600 = 0.003–0.25 范围内，因子1与浓度之间的良好线性关系。线性回归方程为y = 22.5x - 2.59，R² = 0.986，检测限（LOD）计算为 OD600 = 0.003（对应 10⁴ CFU/mL）。如图4f所示，因子1与志贺氏菌在OD600值为0.003和0.2之间的浓度成正比。回归方程为y = 27.9x - 2.45，决定系数R²为 0.996，检测限（LOD）为 OD600 = 0.003（对应 10⁴ CFU/mL）。

图4 传感器阵列对大肠杆菌和志贺氏菌的定量性能。

总结

这项研究开发了一种基于四种功能化具有类过氧化物酶活性的DNA纳米酶的压力传感器阵列，通过便携式压力计对食源性病原体进行多重检测。得益于4-巯基苯硼酸和β-巯基乙胺的功能化，四种DNA纳米酶与九种细菌之间的非特异性相互作用的多样性导致压力响应模式的差异，这通过催化H₂O₂生成独特的“指纹”信号来实现。作为处理多变量数据的有效统计工具，主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）被用于通过分析压力响应模式来识别九种食源性病原体。此外，制备的传感器阵列能够区分不同的细菌混合物并实现定量检测，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的平均检测限分别为10² CFU/mL和10⁴ CFU/mL，展示了其在实际样品检测中的良好实用性和令人满意的准确性。这项研究为食品安全监测中食源性病原体的多重分析提供了新的见解。