加速抗病毒药物发现， COVID19带来的经验（上）

在21世纪，人类面临的最严重的公共卫生风险之一就是病毒性疾病的爆发。尤其是2019冠状病毒病（COVID-19）大流行病，已经造成了超过600万人的死亡，这个数字还在持续增加。这场未曾有过的全球卫生危机，对社会、经济甚至心理健康造成了深远的影响，改变了许多人的生活方式。但这场危机也带来了一些重要的教训。在医药行业，COVID-19大流行病刺激了全球范围内的快速、协同的药物研发努力。在短短两年的时间里，多种疗法被发现、审批并投入使用，这在往常的药物研发过程中是前所未有的。

近期发表在《Nature Reviews Drug Discovery 》的一篇论文详细探讨了这一进程，以及从中吸取的经验，为应对未来可能的大流行病做好准备，通过回顾COVID-19大流行期间，活跃在严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）抗病毒发现领域的几家制药公司和学术合作机构的药物研发经验，包括靶点选择、药物化学、抗病毒检测、动物疗效和预防耐药性等。《国际医药商情》从这篇文章出发，特此整理，期望这些教训能对未来的药物研发具有启示作用，帮助更好地应对可能的大流行病，保护全球公共卫生。

研发策略与靶点选择

抗病毒药物疗法可以针对宿主（人类）或直接针对病毒本身。针对宿主的抗病毒药物主要针对的是病毒生命周期中至关重要的人类蛋白质。大量的努力已经投入到寻找针对新冠病毒（COVID-19）的宿主导向疗法中，其中最值得注意的是多次进行的药物再利用筛选。一些这样的药物已经进入了临床试验阶段，例如通过“加速COVID-19治疗干预和疫苗”（ACTIV）和“新冠病毒治疗的随机评估”（RECOVERY）等平台进行的试验以及由公司赞助的试验。

然而，到目前为止，还没有批准的针对COVID-19的宿主导向抗病毒疗法。有人认为，宿主导向疗法的优势在于它具有较高的抗病毒抗药性壁垒，如果靶点蛋白质被多种病毒使用，就可能具有广谱活性。然而，这种方法也存在一些缺点，比如可能会出现由于宿主途径介导的毒性，如果病毒生命周期利用多种冗余靶点，则疗效可能较低，且在活体模型中的转化效果可能较差。历史上，唯一成功的针对宿主的抗病毒药物包括对丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的干扰素，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）的CCR5拮抗剂，以及例如alisporivir（Debio-025）等环孢素抑制剂在HCV的晚期临床开发中。因此，大部分被批准的抗病毒药物直接针对病毒蛋白质，应该重点关注与严重急性呼吸综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）相关的靶点。

在开始药物研发工作之前，选择靶点至关重要。理想的抗病毒靶点对病毒生命周期至关重要，具有可控的作用机制，可以被具有药物特性的小分子抑制，并且对突变具有高的适应性壁垒。

在缺乏临床验证的情况下，如果一个靶点的作用机制已经被理解，且已经证明消除蛋白质功能直接影响体内或体外的病毒复制，那么这个靶点就更可信。这可以通过化学探针或逆向遗传学方法来实现。抗病毒治疗的靶点是化学抑制靶点。因此，关键问题是：蛋白质上是否有可被小分子作用的位点；是否作用这些位点可以调节蛋白质功能；以及调节蛋白质功能的化学探针是否也能在细胞检测中导致病毒抑制。

除了直接的临床证据或强烈的机制证据外，还可以通过评估靶点在病毒家族或流行变异中的保守性来评估靶点的显著性。可以对整个蛋白质或活性结合位点进行序列和结构保守性的评估。被视为更稳健的靶点是保守的，因为对病毒生命周期至关重要的靶点应该积累较少的突变。即使是一个变异灵活的靶点是必要的，也很难进行药物治疗，因为分子需要能够强烈抑制所有的变异。针对一个保守的病毒蛋白质也增加了开发广谱抗病毒药物的可能性，这是大流行病防备的一个重要优先事项。

临床验证的新冠病毒药物靶点

新冠病毒基因组编码四种结构蛋白和两种开放阅读框多肽。这些多肽由两种半胱氨酸蛋白酶进行切割：主要由非结构蛋白5（NSP5）主蛋白酶（Mpro）负责，该酶在11个位置进行切割，以及由NSP3乳胶酶样蛋白酶（PLpro）负责，该酶在3个位置进行切割。这些切割步骤释放出较短的病毒蛋白，如RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）NSP12，这些蛋白对病毒复制和逃避宿主免疫反应至关重要。例如，Mpro直接切割了NLRP12和TAB1，这两种调节炎症途径的分子，这可能揭示了新冠病毒感染者产生过量细胞因子和炎症反应的分子机制。
至今，唯一在临床使用或处于临床后期试验阶段的口服新冠病毒治疗药物主要靶向NSP5 Mpro或NSP12 RdRp，预计Mpro和RdRp将在未来3-5年内仍是最主要的靶标蛋白。

NSP5 Mpro
在疫情初期，许多公司都开始研发针对Mpro的项目，现在有几种针对SARS-CoV-2 Mpro的抑制剂已经处于紧急使用授权（EUA）阶段或在临床试验阶段。Mpro是一个吸引人的靶标，主要基于以下几个因素。首先，机制的理解，因为多肽处理中蛋白酶的功能得到了良好的描述，并且由于Mpro抑制直接抑制病毒复制，如在其他病毒中观察到的Mpro，所以可以进行试验。此外，Mpro结构的快速可用性促进了基于结构的药物设计工作。其次，半胱氨酸蛋白酶是一类已知可以成药的酶，其氨基酸序列和切割特异性与人体的半胱氨酸蛋白酶不同。第三，有临床先例，因为有多种针对HIV和HCV的蛋白酶抑制剂已经在临床使用，而且一种针对人类鼻病毒（HRV）的蛋白酶抑制剂在II期临床试验中降低了病毒滴度。第四，化学探针验证，2003年亚洲SARS-CoV大流行后报道了多个针对Mpro的SARS-CoV化学探针。SARS-CoV和SARS-CoV-2 Mpro之间的序列相似性达96%，因此，一些化学探针被迅速部署用于SARS-CoV-2。例如，PF-00835231在2003年SARS-CoV大流行期间进行了临床前开发，然后被证明对SARS-CoV-2有活性，并在2020年作为静脉输注治疗进入临床I期试验（NCT04535167）。随着口服生物利用度更高的后续化合物nirmatrelvir的开发，PF-00835231没有进行进一步的临床研究。此外，对诺如病毒3C蛋白酶的研究导致了GC376的开发，这种化合物在诺如病毒、小核糖核酸病毒和冠状病毒家族中具有良好的活性，在猫冠状病毒模型中具有疗效。

NSP12 RdRp
RNA病毒的复制需要一个合成病毒RNA的机制。RdRp催化RNA从RNA模板的复制，合成一个互补的RNA链。因此，抑制RdRp就抑制了病毒复制。与Mpro类似，由于几个原因，SARS-CoV-2 RdRp的催化亚基被验证为一个靶标。首先，机械性理解，因为RdRp在RNA病毒中的结构和功能都已经被很好的理解。其次，有临床先例，因为有多种RdRp抑制剂已经在临床使用或为HIV、HCV、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感A和流感B研发中，增加了对冠状病毒RdRp作为相关靶标的信心。第三，已经开发出了广泛的RdRp抑制剂，进行化学探针验证。其中一些已经成功用于对抗SARS-CoV-2感染，例如，remdesivir和随后的molnupiravir。特别是，remdesivir对冠状病毒的广谱抗病毒活性在SARS-CoV-2大流行之前就已经公布，以及它的生化作用机制。尽管这两种分子接触相同的靶点，并需要内源性细胞机制的代谢激活，但一旦激活，remdesivir和molnupiravir的机制是不同的：remdesivir导致RNA复制的延迟终止，而molnupiravir导致RNA产物的突变。

值得注意的是，其他重新定位的RdRp抑制剂，如favipiravir或sofosbuvir，尽管在选定的细胞检测中显示出一些抗病毒活性，但在SARS-CoV-2临床试验中并没有影响死亡率和住院率。第四，RdRp的催化部位的序列在各种冠状病毒和SARS-CoV-2的变体中广泛保守。此外，尽管抑制人 RNA 聚合酶是 RdRp 抑制剂脱靶毒性的一个来源，但 RdRps 不由人类细胞编码。

化学证据及遗传证据角度的靶点

NSP3蛋白酶（NSP3 PLpro）
 NSP3蛋白酶具有类似木瓜蛋白酶的结构，它能够在多肽链的N端切割三个位置，生成成熟的NSP1、NSP2和NSP3。它的活性部位包含一个典型的蛋白酶催化三重基团，由Cys112、His273和Asp287组成。除了在病毒复制中的基本作用，PLpro还能够切割泛素、ISG15和IRF3，这些都是宿主先天免疫途径的已知调控者。针对SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro的非共价抑制剂已被发现，而且PLpro的抑制与细胞抗病毒活性有关。

病毒复制
NSP13解旋酶是RdRp复制复合物的一部分，它能催化RNA从5′端到3′端的解旋。它还对复制复合物的校对和模板转换功能是必需的。尽管还没有报道任何针对冠状病毒解旋酶的化学探针，但晶体学片段筛查暗示它是一个可行的靶点。已经有病毒解旋酶抑制剂用于其他感染的治疗。

逃避宿主免疫
病毒感染后，被宿主的模式识别受体（PRRs）识别的病毒组分会引发抗病毒的固有免疫反应。病毒通过瞄准一系列的信号通路（例如Toll样受体信号通路和经视黄醇酸诱导基因I（RIG-I）或黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）的细胞内信号通路）来规避这种固有免疫反应。

NSP3宏域
作为固有免疫反应的一部分，宿主ADP-核糖转移酶将ADP-核糖转移到病毒蛋白上，最终有助于抑制病毒复制。NSP3的病毒宏域Mac1通过切割已转移到病毒蛋白上的ADP-核糖来抵制这种固有免疫反应。

NSP14和NSP16甲基转移酶
甲基转移酶能催化甲基从S-腺苷蛋氨酸转移到RNA底物。NSP14在NSP10的配合下催化鸟嘌呤的N-甲基化，而NSP16则通过2′-O-甲基化病毒mRNA的核糖来完成RNA帽的形成。

NSP15内切酶
NSP15内切酶是EndoU家族的一部分，这是RNA尿苷特异性内切酶，能够通过在尿苷的3′侧切割来产生2′, 3′环磷酸和5′羟基末端，从而作用于病毒RNA。在冠状病毒科、Areriviridae和Roniviridae中，尿苷特异性内切酶都是高度保守的。

药物化学

一旦确定了靶点，药物化学就成为了一个设计、制作和测试分子的迭代过程，以将化学起点推进到候选药物的开发。在设计适当的药物化学策略时，设定一个实际的治疗剂特性目标是重要的，以便最终产品具有足够的治疗价值。这些目标通常分为目标产品概要（target product profile，TPP）或目标候选概要（target candidate profile，TCP）。TPP描述了治疗剂的临床属性，而TCP描述了分子必须满足的分子属性，例如目标参与、细胞抗病毒反应、安全药理学。在此讨论TPP，其有助于开发特定目标的TCP。

理想的抗病毒药物发现环境中，直接作用的抗病毒药物的TPP目标是一个可以口服的药物，每日给药一次，或对于像SARS-CoV-2这样的急性感染，甚至只需要给药一次。此外，一个广泛的治疗窗口是可取的，以适应对快速诊断能力有限的患者群体。

然而，对于即时的大流行病应对，许多这些规格是奢侈的，可能可以接受较低的TPP要求。考虑到情况的紧急性和对最脆弱人群的分析，以下的限制单独或组合可能是第一代抗病毒疗法可以接受的。首先，次优的剂量方案，每日可达三次或四次。其次，次优的给药途径，包括针对选定的高风险患者的静脉注射制剂。虽然这对早期感染的广泛治疗并不实用，但是有效的静脉注射剂remdesivir在SARS-CoV-2大流行病中获得了EUA和FDA的全面批准，并且第一个SARS-CoV-2 Mpro抑制剂作为静脉注射剂进入临床试验。第三，次优的分布、代谢和药代动力学（DMPK）特性，同时确保在体内测定的自由药物的谷浓度（Cmin）高于在细胞试验中定义的蛋白质调整后的90%有效浓度（EC90）。持续的体内药物浓度超过EC90通常被认为是达到抗病毒效能的最低要求，并且对于第二代抗病毒药物，理解抗药性后，可能需要更高的谷浓度。第四，对狭窄的患者队列和对可能的药物-药物相互作用的监测愿意考虑。临床可管理的药物-药物相互作用，与药代动力学增强剂的联合用药或机制动作，阻止在选定患者群体中的使用，例如生育潜力的女性，可能是选定的高风险患者群体在大流行病中可以接受的。第五，接受短疗程窗口。对于某些病毒疗法，如针对流感的奥司他韦，需要迅速的治疗才能实现抗病毒效果。然而，给患者开处方并分发药物在症状发作后的48小时内可能具有挑战性，如果抗病毒疗法在症状发作后的5天内仍然有效，那么治疗的延迟就是可以接受的。

关于SARS-CoV-2，临床观察中有几个可能需要对TPP进行额外修订的地方，比如观察到在接受治疗和未接受治疗的病人中都有病毒动力学的双相性或“反弹”现象，以及被称为后急性COVID-19综合症（PACS）或常说的“长新冠”的各种慢性神经、心血管和胃肠症状。这些观察到的症状的病因尚不清楚，可能涉及到几个因素，对TPP有影响。首先，药物的自由浓度可能不足以充分抑制病毒复制，因此，可能需要以覆盖EC90倍数的Cmin为目标。其次，病毒动力学可能需要更长的治疗时间。第三，可能还存在未被针对的病毒储存。尤其是，SARS-CoV-2感染对于急性和慢性阶段的中枢和周围神经系统的影响尚不清楚，所以在TPP中可能需要不同的组织分布剖面。最后，对于PACS，免疫触发因素可能在临床上有意义，可能需要超出直接作用的抗病毒药物的宿主导向的方法。

最后，TPP可能需要进行精细调整，以适应与大流行预备和提高阻力屏障相关的特征。可能需要的是具有增加的抗病毒治疗谱的化合物，以覆盖来自病毒家族的几个病毒株，甚至是跨越病毒家族。然而，增加谱带来了药物化学的挑战：一个化合物需要达到通常是冲突的、同时抑制相关病毒的蛋白质，但避免相关宿主蛋白质和引起非靶点效应的目标。
（未完待续）

综合编译自von Delft, Annette, et al. "Accelerating antiviral drug discovery: lessons from COVID-19."
　　　　　 Nature Reviews Drug Discovery (2023): 1-19.

来源：荣格-《国际医药商情》

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