一种简单的糖基成分对皮肤保湿的影响:生物学作用方式和临床效果（一）

摘要

目的: 本研究旨在研究基于糖的结构，即 XAX（木糖醇基葡糖苷-脱羟基木糖醇-木糖醇）在体外和体内对皮肤屏障功能和保湿的影响，并将其功效与甘油进行比较。

方法: 通过RT - qPCR分析对局部处理的人类重建表皮进行基因表达研究。在局部处理的人皮肤外植体中通过色谱法测量神经酰胺新合成。在原代细胞培养物中监测必需蛋白质的产生：使用色谱法测定成纤维细胞中监测硫酸软骨素和透明质酸；使用ELISA角质形成细胞中的透明质酸。对25名皮肤干燥的女性志愿者测量了表皮微起伏、皮肤电容和经表皮水分流失（TEWL）。还测量了手上的皮肤电容和TEWL，并比较了水醇凝胶。

结果: XAX增加了关键保湿相关基因的表达，例如角质形成细胞间连接、角化层、脱屑过程以及皮肤屏障功能和水合作用的酶、结构成分或调节因子。它还增加了神经酰胺、透明质酸和硫酸软骨素的含量。3%的XA X处理降低了TEWL并增加了皮肤电容、皮肤微观纹理和脱屑。与单独使用甘油相比，XAX+甘油（1.5%+1.5%）的组合显示出有趣的效果。

结论: XA X对涉及皮肤屏障功能的生物学通路即表皮和真皮水储备、表皮水循环有促进作用。证实，无论是单独使用还是与甘油结合使用，使其成为基本润肤剂、润湿剂和封闭剂的有趣替代品。

引言

皮肤是覆盖全身的复杂器官。它的一些主要功能是保护身体免受环境的侵害，并有助于其体内平衡。皮肤保湿是健康皮肤外观的关键（Draelos, 2018）。例如，干燥的特征是粗糙，表面呈纸莎草状，存在凸起的鳞片和/或鳞屑以及刺激（Haftek , 2015）。表皮是皮肤最表层的组织，对皮肤的屏障功能起着很大的作用。

这种不断自我更新的多层组织主要由角质形成细胞组成（85-95%）。角质形成细胞经过严格调控的分化程序，依次形成皮肤的基底层（SB）、有棘层（SS）、颗粒层（SG）和角质层（SC）（Goleva et al., 2019; Lefèvre-Utile et al., 2021）。正确的角质细胞分化和表皮稳态是确保皮肤水合状态的必要条件。每个表皮层都含有特定分化阶段的角质形成细胞，并通过其特有形态和生化特征的表达来定义，目的是产生一个内聚组织。

例如，基底角质形成细胞具有高增殖能力，是表皮维持和再生的关键。角蛋白（KRT） 5和14的表达是这些细胞的特征。 此外，人类1号染色体上一个2 mb的位点称为表皮分化复合体（EDC），由60个基因编码参与角化细胞分化和SC特性的蛋白质（Henry et al., 2012）。在这些蛋白中，重复蛋白（RPTN）被检测到与颗粒状角质形成细胞以及loricrin兜甲蛋白（LOR）和聚丝蛋白（FLG）密切相关。随着角化细胞的分化，外皮蛋白Involucrin (IVL)和LOR的表达增加。转谷氨酰胺酶（TG），特别是TGM1，交联IVL, LOR和其他结构蛋白，形成凝固的包膜，并提供SC的机械强度（Goleva et al., 2019）。角化前不久，角化细胞合成并分泌角膜粘连蛋白（CDSN），其自发嵌入SG桥粒内 （Haftek, 2015）。钙调素样5（CALML5）也是表皮后期分化所必需的（Sun et al., 2015）。最后，角化层主要由两层LOR组成，整个被多层脂质结构和亲水的角细胞内物质包围，主要是天然保湿因子（NMF）。

SC脂质的主要成分是神经酰胺（45%-50%）、胆固醇（25%）和游离脂肪酸（10%-15%）。神经酰胺是形成经皮水分流失的天然屏障所必需的（Lefevre-Utile et al. , 2021）。最后，为了实现脱屑过程，CDSN必须被蛋白酶和桥粒钙粘蛋白降解。 尤其是KLK5和KLK7，可以切割角膜桥粒的细胞外成分，如CDSN，使细胞连接松动并使剥离（Haftek , 2015; Mc Govern et al., 2017)。

除了适当的角质细胞分化和SC结构外，表皮内的水运输主要由水通道蛋白（AQP）和紧密连接（TJ）调节。TJ存在于颗粒层中，构成细胞间的封闭（Zaniboni et al., 2016）。在这些蛋白质中, 紧密连接蛋白（CLDN）, 闭合蛋白, 闭锁小带（ZO）, 扣带蛋白（CGN）和多PDZ域蛋白（MUPP-1）都与功能性TJ屏障有关（Crawford & Dagnino, 2017）。

真皮层影响皮肤的生物力学特性，如柔韧性，对皮肤表面的外观以及皮肤的含水量也有积极的影响。 这主要是由于细胞外基质（ECM）成分的存在。 其中，糖胺聚糖（GAG），尤其是透明质酸（HA）作为皮肤的蓄水池，参与皮肤保湿（Sodhi & Panitch, 2021）。例如，透明质酸能够在水中结合其重量的1000倍。相反，GAG含量的降低会引起皮肤干燥。与透明质类似，硫酸软骨素（CS），另一种GAG，当与蛋白聚糖结合时，如聚蛋白多糖，在保持水分方面起关键作用。

分析一种成分对这些典型基因和蛋白质表达的影响，对了解其作用机制具有重要意义。皮肤水合作用对保持皮肤健康至关重要，这解释了为什么润肤霜是基础皮肤护理的重要组成部分。事实上，这是世界上大多数地区所有年龄层的人的普遍需要。

在此背景下，本研究旨在研究一种特定的糖基结构（液体和水溶性）在体外和体内的作用。例如XAX （INCI: 木糖醇基葡糖苷-脱水木糖醇-木糖醇）, 对皮肤的屏障功能和保湿。在大多数体外模型和特定的临床试验中，通过测量水-酒精凝胶对皮肤脱水的预防作用，比较XAX与甘油的功效。

方法

1. 保湿相关基因在人体重建表皮三维模型中的表达
重建表皮（EPI/001; StratiCELL®, Belgique）在专有的无血清培养基中置于气液界面，并在37℃ 和5% CO₂的潮湿气氛中保持。14天后表皮完全分化时，局部应用安慰剂水包油乳液（不含XAX）或含有3% XAX的相同配方（表1），浓度为2mg /cm2。实验是在重复培养中实现的。孵育24小时后，按照供应商的建议，使用总RNA小提试剂盒（Qiagen，美国）提取表皮组织的总核糖核酸（RNA），并将其反转录成互补DNA （cDNA）。使用专用微流体技术的384孔TaqMan阵列（Applied Biosystems, USA），对92个与表皮分化和皮肤屏障功能相关的基因进行qPCR分析。计算周期阈值（Ct）， 并使用Applied Biosystems的Data Assist软件进行基因表达分析。 将清洁基因（hk）的Ct值归一化，并通过以下计算获得相对数量（RQ）：2-(△Ct治疗组-△Ct安慰剂治疗组参照组)，其中△Ct=每个cDNA样本的Ct靶基因- Ct hk。仅考虑RQ值大于1.4且标准差小于30%的基因。使用genesspring®软件（Agilent）进行显著通路分析。

2. 人体正常皮肤外植体神经酰胺合成的测定
本文从一位35岁妇女的腹部整形术中制备了人体皮肤外植体。直径为8mm的皮盘在MEM/M199（3:1, Gibco）培养基中培养，并添加50 IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.2% (w/v) 碳酸氢钠、2% 胎牛血清（FCS; SeraTech Zellbiologische produckte, Skt Salvator，德国）和1μCi/mL碳14标记的醋酸酯（Gibco）。

将安慰剂霜凝胶或含3%甘油或3% XAX的相同配方（表1）以2mg /cm2的浓度涂于皮肤外植体表面。以表皮生长因子（EGF）10 ng/mL为参比分子，在皮肤外植体培养基中进行检测。对照皮肤外植体也在没有产品的情况下孵育。皮肤外植体在 37℃下孵育：- 5% CO2孵育18小时（3次）。孵育结束时，通过可控热冲击（MilliQ水，2分钟，62℃）将表皮与真皮层分离，并用胰酶1% （ICN Biomedicals Inc.，USA）在37℃下消化过夜。

新合成的脂质用碳14标记，在有机相（甲醇/氯仿(1:2)）和水相（0.25 M氯化钾）之间进行分离。然后有机相在氮气下蒸发，残留物被吸收在（2:1）氯仿/甲醇混合物中。然后将样品（20μL，对应3700计数/分钟，cpm）涂于silica60色谱板（Merck, Allemagne）上，在三种连续溶剂中洗脱:氯仿/丙酮/甲醇（38:2:10）；氯仿/丙酮/甲醇（40:5:5）；氯仿/乙酸乙酯/醚/甲醇，（36:10:3:1）。 用适当的标准将神经酰胺1和2的位置与其他表皮脂质区分开来。使用放射性分析仪（Storm,UK）对分离点的放射性进行计数。结果以表皮的cpm/mg为单位表达。计算各治疗组的均值和标准差。治疗组与对照组比较采用Student's t检验（p<0.05）。

3. 正常人体角质形成细胞中透明质酸含量的测定
正常人表皮角质形成细胞（NHEK），来自37岁女性供体（Lonza, b<e:1>，瑞士）在角质细胞生长培养基（KGM）Gold（Lonza）中的48孔板中培养，在5% CO2的37℃潮湿环境中培养5天。然后，NHEK用0.01%或0.1% XAX或参比分子，即0.2μM维甲酸（Sigma- Aldrich）（四次处理）处理（或不处理）。 孵育24 h后，每孔取上清液150μL测定HA。在孵育结束（48 h）时，用RIPA缓冲液分析细胞以定量总蛋白。

采用特异性酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Hyaluronan DuoSet kit, R&D Systems, Minneapolis, USA）测定上清液中HA的含量。用二喹啉甲酸测定法 （Interchim, France）测定细胞裂解物中的总蛋白含量。计算各组归一化HA数量（ng HA/ μg总蛋白）的平均值和标准差，以及与对照组（未经处理的细胞）比较的变化百分比。采用Student's t检验评定统计学显著性，p<0.05为显著。

4. 正常人体真皮成纤维细胞中透明质酸和硫酸软骨素含量的测定
正常人真皮成纤维细胞（NHDF）， 来自36 岁女性供体（Biopredic International, France）在MEM/M199（3:1, Gibko）培养基中培养，添加2mMl-谷氨酰胺、50 IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.185% (v/ v)碳酸氢钠和10% FCS，在37℃、5% CO2的潮湿环境中培养。13天后，细胞不受XAX（0.001%，0.01%或0.1%），甘油（0.01%或0.1%）或参比分子，即10 ng/mLEGF（三次重复）的处理。孵育4天后，收集上清液测定透明质酸（HA）和硫酸软骨素（CS）的剂量。用美国Sigma-Aldrich公司的stainall染色后，分别在630 nm和450 nm处用分光光度法进行定量。结果以μg/mL HA或CS表达。对于每个治疗组，计算平均值和标准差（SD），以及与对照组（未经处理的细胞）相比的变化百分比。治疗组与对照组比较采用Student's t检验（p<0.05）。

5. 设计人体皮肤水合作用的临床试验，将3% XAX乳液与安慰剂乳液进行比较
医学控制下，对25名女性志愿者（平均年龄：40岁，22~60岁）进行了随机双盲临床研究，受试者腿部皮肤干燥（角膜测量值在45±5% ~ 55±5%任意单位(a.u)之间）。

在研究的第一天（D1），以2mg /cm2的剂量将安慰剂水包油乳液和添加3% XAX的相同配方（表1）应用于一条腿的外侧。

将未应用产品的区域作为 “绝对控制”区域，以遵循第一天测量的可变性:D1T0在任何应用产品之前，d1t8在第一次应用产品后8小时。随后，志愿者们在腿上使用了这些面霜（每条腿一个；随机）每日2次，从D1晚至D29晚。分别于涂抹后15天和30天后进行中期和最终测试。每次，志愿者到达评估中心时都没有涂抹任何面霜（最后一次涂抹必须在大约12小时前）。所有测量均在空调室内（18±1℃，相对湿度55%±5%）进行，并在志愿者适应环境至少30分钟后完成。

1）纹理和脱屑评价
在每次测量（D1T0, D15和D30）时，使用Diagnoskin®从腿部外侧区域采集一个SC样本。在恒压下（约150 g/cm2，持续10s）将可控制黏附性的透明方片施加于测量区域，然后剥离。显微检查评估微结构网络(皮肤微纹理)和脱屑的形态学分析，并通过验证评分（评分从1到12）进行量化。 计算每个测量时间的平均值、SD和SEM，以及安慰剂平均值和XAX平均值之间的变化百分比。

2）皮肤电容测量
在D1T0、D1T8h、D15和D30时测定皮肤水分。每次，使用CM 820TM测角仪（Courage and Khazaka Electronic Gmbh）对每条腿的外部进行三次测量和平均值。SC含水率计算公式为：Z={R2+[(1/(2π fc)]2}½，其中Z：阻抗；R：阻力；f：电流频率，C：容量。得到的值用a.u表示（Jemec & Na,2002）。

3）TEWL测量
在D1T0, D1T8h, D15和D30进行TEWL测量。利用蒸发仪（Tewameter TM 210;Courage and Khazaka electronics Gmbh）。结果以g/m2/h表示。

4） 数据处理
对于每个产品，计算每个测量时间和点的平均值和SEM（测角法和TEWL）。
根据以下公式计算安慰剂与XAX在不同时间的变化百分比：%=(TAtiXAX - TAtiplacebo)/ TAtiplacebo
（TA :处理区域的平均值 / ti: 在产品应用后的不同测量时间）。

对于皮肤电容，使用Student's t检验对每次测量时的值进行组内和组间比较，显著性水平为5%。对于TEWL，使用Student's t检验分别对每次测量值和随时间变化的值进行组内和组间比较。

6. 设计手部皮肤水合作用的临床试验，比较分别含1.5%XAX+1.5%甘油或单独3%甘油的水醇凝胶。
一项临床研究在医学控制下对三组20名不同皮肤类型的女性志愿者进行（年龄从20岁到63岁不等，平均年龄在41岁到48岁之间，视组而定）试验前有48小时的洗脱期。然后，志愿者必须使用安慰剂水醇凝胶和添加3% XAX或添加1.5% XAX+1.5%甘油的相同配方（表1），每天至少5次（平均应用次数:每天8次），并有适当的使用说明。

1）皮肤电容测量
皮肤保湿度的测量使用CM825®（Courage & Khazaka, Electronic GmbH）测角仪。（德国科隆），在任何产品应用前T0和产品使用24小时后。

2）TEWL测量
使用Tewameter300®（Courage    and Khazaka, Electronic GmbH）在任何产品应用前T0和产品使用8天进行Tewameter 300®测量。

3）自我评估
在研究结束时，通过自我评估问卷调查志愿者对测试产品的意见。

4）数据处理
对于每个产品，计算每个测量时间和点的平均值、SD和SEM（测角法和TEWL）。 根据每位志愿者的变化百分比的平均值[(TAti-TAt0)/TAt0]×100，计算变异与T0的百分比。根据公式计算与安慰剂的差异百分比::{[(TAti-TAt0)XAX-(TAti-TAt0)placebo]/[TAt0XAX+(TAti-TAt0)placebo]}×100（式中：TA：处理区域得到的平均值/t0：产品应用前/ti：产品应用后不同测量时间）。

自我评估问卷的结果以指定特定判断（在建议的判断中）的受试者的百分比（%）计算。仪器数据进行Student's t-test检验。对原始数据与基线（T0）进行组内统计分析。进行组间统计分析，比较每个实验时间每种活性产品与相应安慰剂产品记录的变化。当p值<0.05时，认为差异有统计学意义。

结果

1. 人体重建表皮中皮肤水合作用相关基因的表达对RT-qPCR调查结果进行的倍数变化和通路分析显示，与安慰剂治疗相比，在3D重建的人表皮上局部应用含xax的配方可诱导编码皮肤屏障功能、皮肤水分储备和表皮水循环相关蛋白的基因上调（表2）。水通道蛋白3的表达也有所增加，但未达到阈值（即1.32;数据未显示）。

2. 神经酰胺在人体皮肤移植模型中的新合成

采用皮肤外植体模型研究XAX对神经酰胺新生的影响。

在我们的实验条件下， 在皮肤外植体培养基中以1 0ng/mL的浓度检测EGF，与未处理的外植体相比，表皮神经酰胺1和2的新合成增加了61%（p<0.05；图1）.配制成浓度为3%的XAX并应用于皮肤外植体表面，与未处理的外植体相比，表皮神经酰胺1和2的新合成增加了139%（p<0.05；图1）。与未处理的外植体相比，安慰剂配方增加了73%，但没有统计学意义（图1）。与未处理的外植体相比，3%配方的甘油对表皮神经酰胺1和2的新合成没有显著影响（+28%；图1）。

未完待续，更多体外及临床试验结果、结果讨论、参考文献见7月刊

来源：荣格-《国际个人护理品生产商情》

原创声明：
本站所有原创内容未经允许，禁止任何网站、微信公众号等平台等机构转载、摘抄，否则荣格工业传媒保留追责权利。任何此前未经允许，已经转载本站原创文章的平台，请立即删除相关文章。