无细胞疗法改善皮肤光老化

从古至今，人类对永葆青春的追求一直没有停歇，从“嫦娥应悔偷灵药”的神话传说到秦皇汉武求仙问药，再到如今的各种医学美容研究，追寻年轻，容颜永驻似乎成了主旋律。

近年来，科研人员发现干细胞及其衍生物，如细胞外囊泡对很多细胞有重要靶向作用。哈尔滨医科大学附属第二医院整形外科肖志波教授在紫外线照射的成纤维细胞的细胞外囊泡中，检测到393个差异表达的微小核糖核酸，并发现有的微小核糖核酸能够直接对生长分化因子起到作用。这些结果为促进皮肤修复和治疗皮肤光老化提供了一种“无细胞治疗”方法。

该研究成果发表在国际顶级期刊《Chemical Engineering Journal》2023年第1期，论文影响因子高达16.744。

一、研究逻辑：

1、皮肤衰老，80%来自于紫外线引起的光老化。
皮肤老化不同于其他器官，皮肤老化会更加肉眼可见，出现像皱纹、松弛、下垂、凹陷等问题，影响自信心。而且皮肤老化不仅受到内在老化过程的影响，还要受到各种外在环境因素的影响，特别是紫外线(UV)照射，其中UVB具有最强的诱变能力。但大家往往会低估了光老化的可怕，BBC就曾做过一档纪录片《美容的真相》，揭秘了衰老的元凶——光老化！该纪录片就提到：皱纹的形成大概有75%的原因归罪于光老化。

光老化会导致人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts，简称HDFs）的数量减少，转化生长因子β（TGF-β）变得失调，这些都会导致胶原和弹性蛋白合成降低，并加速其降解（胶原I和胶原III是HDFs产生的主要成分），从而加速衰老。

2、细胞外囊泡的作用
随着科技发展，科研人员发现干细胞及其衍生物如细胞外囊泡对很多细胞有重要靶向作用。曾经是被当成细胞分泌的垃圾（细胞分泌的小囊泡），如今摇身一变成为研究的“新宠”，这是因为细胞外囊泡不仅可以携带上脂类、DNA、mRNA、miRNA等信息，在细胞间传递信息，还可以通过受体介导的交互作用直接刺激靶细胞，或通过向靶细胞转移各种生物活性分子发挥其生物学作用。

所以，近年来，细胞外囊泡作为“无细胞治疗”的策略，掀起了一阵热风，随着各种相关技术的发展，越来越多的研究者将目光投向了利用细胞外囊泡进行疾病的诊断，预后及治疗临床应用。目前在一些发达国家已经开展了细胞外囊泡的临床应用研究。

这也是这篇研究的一个亮点，走在科技的前沿。另外无细胞疗法比细胞疗法安全很多。细胞治疗要把细胞移植到自体或者异体内，会存在分化不确定性和生物安全性问题，目前尚未彻底解决，因此把来源于移植细胞并发挥主要作用的分泌因子或细胞衍生物代替其来源的母细胞移植体内，具有安全可控性，比细胞移植更具优势。

3、微小核糖核酸调节生长分化因子
微小核糖核酸（miRNA）之miRNA-22-5p是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNAs，人体内大约2/3的基因都受到某个或一组miRNA的调控。可以结合靶标信使RNAs（mRNAs）来抑制蛋白质翻译，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育等方面起重要作用。

miRNA-22-5p（miR-21-5p）是微小RNAs（miRNAs）家族成员之一，可以作用于不同的靶基因进而发挥相应的生物学效应，这些小的miRNA通常非常稳定，不容易降解，能顺利进入血液，并长期滞留。作用时靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs调节基因的表达，防止它们翻译成为蛋白，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序，疾病等方面都起到重要作用。这篇文章中证明了miR-21-5p可以靶向调控生长分化因子11(GDF11)，从而改善光老化。

4、生长分化因子的作用
GDF11生长分化因子11(GDF11)是TGF-β超家族的成员，被认为是一种抗衰老因子。GDF11可以改善心室肥大，并维持小鼠骨骼肌的稳态。GDF11可促进衰老小鼠大脑的神经源性和血管再生，并对骨骼、肺、心脏、肝脏和软骨有积极作用。此外，GDF11在皮肤生物学中起着关键作用，与新生儿HDFs相比，其在来自成人捐赠者的HDFs中的表达和活性减弱。然而，它在人真皮成纤维细胞和皮肤组织中的功能这一点尚未阐明。

综上，下调HDF-EVs中的miRNA-22-5p可以通过靶向调节GDF11治疗皮肤光老化。这一发现为改善皮肤光老化提供了潜在的无细胞疗法，为紫外线损伤皮肤修复、抵抗皮肤衰老提供了治疗策略，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。

接下来，我们具体来看看是怎么论证的，得到的具体结果如何？

二、论证过程和结果：

1、    皮肤组织中GDF11的表达与年龄和性别相关
从123名供体获得废弃的正常皮肤组织样本，评估皮肤组织中GDF11的表达。
根据捐献者的年龄，按性别将所有样本分为年轻(2-30岁)48个、中年(31-54岁)49个和老年(55-90岁)组26个。其中女性63例，男性60例。用qRT-PCR对123个样品进行评估，验证皮肤组织中GDF11蛋白的水平(图1)。结果显示老年组女性GDF11表达水平明显高于男性，GDF11的表达与年龄相关。另外，GDF11的表达水平也与年龄相关。

图1: GDF11的表达水平与性别、年龄相关

图2：HDF-EVs和UVB-HDF-EVs中差异表达
的前11个上调和下调miRNA的聚类热图

2、UVB照射的HDF Evs中miRNA上调
差异表达miRNA的聚类热图显示，与HDF-EVs相比，UVB照射的HDF-Evs会引起相关的miRNA上调和下调(图2)。其中149个miRNAs下调，244个上调。我们进一步关注差异表达的miRNAs。在HDFs中，miR-22-5p在UVB照射后上调，这表明具有最高倍数变化的miR-22-5p可能在光老化过程中起重要作用。

注：nc代表阴性对照
图3F：不同组转染后测定荧光素酶活性。
图3G，H：通过蛋白质印迹检测HDFs中GDF11的蛋白水平(每组n=4)。

3、GDF11是miR-22-5p的直接靶点
在差异表达的miRNA中，选择前五个上调或下调的miRNA，使用miRNA靶预测软件TargetScan和miRanda进一步预测下游基因。有趣的是，GDF11被认为是两个miRNAs(miR-22-5p和miR-629-5p)的潜在靶点。此外，进行双荧光素酶报告基因分析和蛋白质印迹来验证这一预测。结果表明miR-22-5p可以直接靶向GDF11，因此它被选为进一步研究。全长GDF11-WT和缺失miR-22-5p结合位点的突变体被亚克隆到载体。重要的是，miR-22-5p mic显著降低了WT组的荧光素酶活性，但突变体中没有降低(图3F)。类似地，miR-22-5p显著降低GDF11的蛋白水平，而miR-22-5p 抑制剂（miR-22-5p-Inh）提高GDF11的蛋白水平(图3G，H)，表明GDF11和miR-22-5p之间的直接相互作用。通过调节miR-22-5p可以调控细胞中生长分化因子的含量，进而再改善光老化。

图4 uvb照射的3D模型的H&E图像，该模型通过在包含nc-EVs、3D nc-EVs、3D miR-22-5pInh-EVs和3D miR-22-5p-Inc-EVs

4、抑制人皮肤成纤维细胞分泌的细胞外囊泡(HDF-Evs)中的miR-22-5p可以达到最佳的治疗效果
细胞外囊泡可以携带细胞来源的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，并参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。并且还具有独特靶向作用。通过下调HDF-Evs中的miR-22-5p,可以靶向生长分化因子并使其过渡表达，从而更好地改善皮肤光老化。

在UVB照射三天后，3D皮肤模型被分为六个治疗组。用EVs处理后，使用H&E染色评估皮肤模型(图4)。所有EV治疗组均表现出UVB损伤的改善，其中3D miR-22-5p-Inh-EVs表现出最好的功效，导致与对照组相比角质层更有序且表皮更致密。相应地，UVB照射引起明显的组织学变化，如角质层紊乱和编织。因此，miR-22-5p-Inh的HDF-Evs可作为潜在的治疗药物。

此外，肖志波教授的团队也进行了动物实验验证，与其他组相比，3D miR-22-5p-Inh-Evs的效果最好，导致光损伤的裸鼠最低水平的细胞凋亡、最丰富的胶原和最致密的表皮。皮肤光老化得到了显著的改善。另外也发现这组显示出更少的炎症因子，也就是能更好地改善炎症。这一结果也更进一步确定EVs中的miR-22-5是一种关键的miRNA，通过靶向HDFs中的GDF11，双管齐下，改善炎症反应，促进胶原合成。HDF-EVs中miR-22-5p的下调展现出了治疗潜力，通过未来的进一步发展，有望成为一种预防光老化的潜在药物。

三、总结展望：

总之，下调HDF-EVs中的miRNA-22-5p可以通过靶向调节GDF11治疗皮肤光老化，可以有效调节HDF的生长、迁移、凋亡和蛋白表达，促进皮肤修复，治疗皮肤光老化。

因此这种“无细胞治疗”方法具有十分重要的理论价值和潜在的临床应用价值，为逆转或延缓皮肤衰老提供了较好的策略和方向。随着相关技术的成熟，未来该研究成果有望转化应用于改善面部皮肤质地、延缓皮肤衰老，从根本上解决一些医美难题，引领生物技术运用到医学美容领域的新潮流。

撰文：巢归研究院联合创始人兼上海实验室负责人 知乎科普主笔  芒奇金

参考文献：

[1]Wu, Hao, Jie Wang, Yue Zhao, Youyou Qin, Xi Chen, Yongting Zhou, and others, ‘Extracellular Vesicles Derived from Human Dermal Fibroblast Effectively Ameliorate Skin Photoaging via MiRNA-22-5p-GDF11 Axis’, Chemical Engineering Journal, 452.P4 (2023), 139553 <https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.139553>

来源：荣格-《国际个人护理品生产商情》

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