沙棘原花青素可延缓皮肤成纤维细胞衰老

近期，西北农林科技大学、伊纳维康公司的相关研究人员在抗氧化物领域国际顶级期刊《Antioxidants》发表研究论文“Anti-Aging Effect and Mechanism of Proanthocyanidins Extracted from Sea buckthorn on Hydrogen Peroxide-Induced Aging Human Skin Fibroblasts”，揭示了沙棘原花青素对人体皮肤成纤维细胞的抗衰老功效及作用机制。成纤维细胞是真皮中合成胶原蛋白的主要细胞，胶原蛋白可以延缓细胞老化，维持和提供皮肤弹性。沙棘，这种植物富含多种生物活性成分，如维生素、氨基酸和类黄酮，因此在食品和制药工业中广受欢迎。沙棘的种子、根、花、绿色浆果和茎中有着高浓度的原花青素。近年来的研究发现，原花青素具有多种生理功能，与心血管疾病、视网膜光损伤、糖尿病和体重减轻有关。本文对这篇研究做出梳理，一探这个值得瞩目的化妆品原料。

氧化应激是导致皮肤老化损害的主要原因。过氧化氢（H₂O₂）引起的细胞内活性氧（ROS）的过度积累，引发胶原蛋白合成的减少和胶原蛋白降解的增加，这是皮肤老化的生物标志。研究人员从多个方面评估了沙棘原花青素（SBP）对氧化应激引起的皮肤老化过程的潜在保护机制。研究人员用300μmoL/L的H₂O₂处理人类皮肤成纤维细胞（HSFs）24小时，之后用25、50和100μg/mL的SBP处理24小时。结果显示，SBP可以提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的活性，有效地清除多余的ROS，并明显改善皮肤细胞中过多ROS引起的细胞形态和生存能力的改变。此外，SBP可以通过TGF-β1/Smads途径促进衰老HSFs中Col I的合成，并通过调节MMPs/TIMPs系统抑制Col I的降解，从而维持ECM结构的稳定，达到抗衰老的目的。最后，研究人员还探究了SBP的迁移能力，结果显示100微克/毫升的SBP最有利于衰老细胞的迁移，为后续动物实验奠定了基础。这些结果将提高SBP在化妆品和抗氧化功能食品行业的应用价值。

沙棘原花青素是什么？

沙棘（Hippophae，Elaeagnaceae）在欧洲、加拿大和美国被广泛种植。由于它富含各种生物活性成分，如维生素、氨基酸和类黄酮，因此在食品和制药行业很受欢迎。

在沙棘的种子、根、花、绿色浆果和茎中发现高浓度的原花青素。近年来，相关研究发现，原花青素具有多种生理功能，因此可用于治疗癌症和心血管疾病，保护视网膜细胞免受光损伤，预防或治疗糖尿病肾病，通过调节脂肪生热和肠道微生物群促进减肥，以及抑制毛细血管高渗透性、脂质过氧化和血小板聚集。少数研究关注SBP在延缓皮肤衰老方面的应用。《Antioxidants》这篇论文的研究者发现，SBP通过与过量的H₂O₂反应，对RAW264.7细胞中过量的ROS含量引起的氧化应激有明显的保护作用，但其机制仍不清楚。对此，研究人员通过用不同浓度的H₂O₂处理人类皮肤成纤维细胞（HSFs），建立了一个衰老模型，研究SBP对H₂O₂诱导的HSFs衰老的保护作用和机制，并探讨其在防止细胞衰老中的作用，以及SBP在化妆品行业和保健品行业的可能应用及其市场价值。

探究沙棘原花青素的功效

为了研究SBP对HSFs的毒性作用，研究人员将无毒浓度范围设定为不同实验处理后80%。选择SBP的浓度范围为0-800μg/mL，用CCK-8方法检测HSFs的细胞活力。结果如图1A所示，表明SBP在400和800μg/mL的浓度下可以促进HSFs的增殖，细胞活力分别达到128%和131%左右，说明SBP可能有利于皮肤细胞的生长。当SBP浓度达到50μg/mL和100μg/mL时，对HSFs细胞活力的影响与空白对照组没有明显差异。因此推测25μg/mL的SBP浓度与50μg/mL和100μg/mL的浓度对细胞活力的影响一致。为了实现细胞的无毒化并保证后续实验中细胞数量的一致性，选择了25、50和100μg/mL的SBP作为后续研究的浓度。

图1

为了验证SBP对衰老细胞的积极作用，研究人员用H₂O₂在0-800μmol/L的浓度范围内处理HSFs，以建立H2O2诱导的衰老模型，并用CCK-8试验检测其细胞活力。如图1B所示，随着H₂O₂浓度从100μmol/L增加到600μmol/L，细胞活力逐渐下降。例如，当H₂O₂浓度达到300μmoL/L时，细胞存活率达到61.45%。当H₂O₂浓度达到400μmoL/L时，细胞存活率下降到36.58%。因此，H₂O₂的半数抑制浓度应该在300和400μmoL/L之间。为了后续实验的方便，研究选择300μmol/L的H₂O₂来建立H₂O₂诱导的衰老模型。

细胞衰老改变了细胞形态。如图2A,C所示，空白对照组的细胞有大的细胞体。它们是具有多个突起的纺锤形或星形扁平细胞。此外，还观察到规则的椭圆形细胞核，细胞轮廓不清楚。衰老模型组中的β-半乳糖苷酶阳性细胞是蓝染的衰老细胞。与空白对照组相比，细胞形态也发生了明显变化，从而降低了细胞的活力。在实验组中，随着SBP浓度的逐渐增加，细胞形态逐渐恢复正常，蓝色衰老细胞明显减少，视野内异常萎缩的细胞数量也大大减少。图2B显示，与对照组相比，H₂O₂诱导的衰老模型的细胞存活率明显降低。同时，SBP实验组可以明显改善H₂O₂诱导的细胞活力下降，而且在浓度为50μg/mL和100μg/mL时效果更好。这说明SBP可以抵抗H₂O₂诱导的细胞衰老，减轻衰老对细胞形态的影响，减少衰老细胞的数量。

图2

由于ROS的增加导致的细胞内氧化应激反应与细胞衰老密切相关。为了探索SBP在细胞衰老模型中的抗氧化作用，研究人员检测了细胞中SOD的活性以及GSH、MDA和ROS的含量。如图3A-C所示，与空白对照组相比，细胞衰老模型中的SOD活性和GSH含量更高，而MDA则低很多。SBP干预了H2O2诱导的衰老模型，随着SBP浓度的增加，SOD活性和GSH含量逐渐增加。另一方面，MDA含量呈现出剂量依赖性的下降。ROS含量是通过荧光分光光度法计算的。图3D,E显示，H₂O₂诱导的衰老模型的细胞内ROS含量最高，视野最亮。与H₂O₂诱导的衰老模型相比，SBP实验组和空白样品组的荧光强度更暗，说明细胞内ROS含量更低。这些结果表明，SBP的抗氧化性能可以减轻H₂O₂诱导的氧化应激引起的细胞衰老。

图3

研究通过免疫荧光染色验证了SBP对H₂O₂诱导的衰老HSF中Col I的表达有积极影响。结合图4A,B，可以得出结论：与空白对照组相比，H₂O₂诱导的衰老模型中Col I的荧光强度较低。至于实验组，中低浓度的SBP（25微克/毫升和50微克/毫升）并不影响Col I在衰老细胞中的表达，而高浓度的SBP（100微克/毫升）可以促进Col I在衰老细胞中的表达。这表明高浓度的SBP（100μg/mL）可以增加Col I在衰老细胞中的表达。

图4

图5

MMP-1和MMP-3的表达可以影响Col I的降解，而它们的表达可以被TIMP-1抑制。根据图4C-E，与空白对照组相比，细胞老化模型组的MMP-1和MMP-3的浓度明显增加，而TIMP-1明显下降。在实验组中，MMP-1和MMP-3随着SBP浓度的逐渐增加而逐渐减少。相反，随着SBP浓度的逐渐升高，细胞中TIMP-1的浓度以浓度依赖的方式增加。因此，SBP可以通过细胞中MMP-1、MMP-3和TIMP-1的表达来调节Col I的降解。

TGF-β1/Smads可以调节细胞中I型原胶原的合成，从而影响Col I的合成和表达。因此，研究人员探究了SBP是否能刺激TGF-β1及其下游效应物Smads蛋白诱导的I型原胶原的产生。如图5B-F所示，H2O2抑制了TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4和I型procollagen的表达以及细胞中p-Smad3/Smad3的比率。然而，如同图所示，SBP逆转了H₂O₂对上述蛋白的影响。随着实验组中SBP浓度的增加，上述蛋白在细胞中的表达逐渐增加。另一方面，图5G显示了对Smad3的磷酸化的抑制作用。低浓度的SBP（25微克/毫升）没有减轻这种抑制作用，而中、高浓度的SBP（50和100微克/毫升）则减轻了这种作用（SBP的浓度越高，效果越好）。这一结果与上一部分的结论一致，证明高浓度的SBP（100微克/毫升）可以增加Col I在衰老细胞中的表达。

细胞划痕实验在一定程度上模拟了细胞在体内的迁移过程。通过观察外围细胞对中心划痕区域的生长（修复）情况，可以确定细胞的生长、迁移和修复能力。24小时后，对细胞迁移率进行了量化。如图6 A-F所示，H₂O₂诱导的衰老模型组的迁移率比空白对照组低62%。加入100 µg/mL SBP后，衰老模型的迁移率明显提高，接近空白对照组的水平。然而，如果单独添加100μg/mL SBP，细胞迁移率比空白对照组低约43%。这表明高浓度的SBP（100微克/毫升）有利于衰老细胞的生长和迁移，但对正常细胞的影响不太明显。

沙棘原花青素如何发挥抗衰作用？

氧化和炎症反应伴随着人体的整个生命过程。当ROS的积累超过了抗氧化防御系统的清除能力，组织细胞就会发生过氧化损伤。皮肤是人体的一部分，暴露在各种外部刺激下，如吸烟、饮酒、紫外线辐射和常见污染物。细胞中ROS的过度积累导致了皱纹、不规则色素沉着和皮肤加速老化。因此，越来越多的研究集中在天然物质对氧化应激损伤的抵抗力上，以延缓衰老。SBP是沙棘中最关键的抗氧化成分，之前的研究证明，SBP具有很好的清除自由基的能力。然而，目前还没有研究确定SBP有能力延缓由氧化应激引起的皮肤老化。为了进一步扩大SBP的使用范围，这份研究探索了SBP抗衰老作用的基本机制。用低、中、高浓度（25、50、100微克/毫升）的SBP处理衰老的HSFs（由H₂O₂诱导），并借助β-半乳糖苷酶染色法观察其对衰老的HSFs、细胞形态和细胞活力的作用。结果发现SBP能明显减少衰老细胞的数量。此外，在SBP的帮助下，细胞形态得到恢复，细胞活力得到提高。为了进一步验证其基本机制，进行了后续实验。

图7

通过实验验证了SBP可以通过提高抗氧化酶的活性和许多非酶性防御机制来消除H₂O₂诱导的细胞氧化应激产生的过量ROS，从而达到抗衰老的效果。SOD和GSH是身体对氧化压力的重要防御系统。它们也是清除ROS的关键酶和抗氧化剂。SOD是一个强大的超氧阴离子（O₂-）清除剂。GSH的独特结构使其成为体内重要的自由基清除剂，它在抗氧化、解毒、提高免疫力和抗肿瘤活性方面起着重要作用。上述两种物质都能保护细胞膜的结构和功能免受氧化物的破坏和干扰。MDA是脂质过氧化的产物。过量的ROS氧化细胞中的饱和脂肪酸后，首先形成共轭二烯氢过氧化物（CD-POV），进一步氧化为环氧化物，然后分解为MDA。进一步氧化后，MDA的浓度逐渐增加。CD-POV、MDA和氧化产物的浓度通常被用作细胞氧化的生物标志物。原花青素具有比维生素C、维生素E和β-胡萝卜素更强的清除ROS的能力，可以迅速中和ROS，减少ROS过度升高对细胞的损害。研究发现了H2O2处理增加了HSFs的MDA含量，降低了SOD和GSH的抗氧化能力，导致细胞内活性氧过剩。用不同浓度的SBP处理后，H₂O₂诱导的细胞内ROS水平的上调明显下降，SOD和GSH的含量增加，MDA的含量下降。这些结果表明，SBP可以提高抗氧化酶和抗氧化剂的活性，有效清除多余的ROS，降低细胞内氧化应激刺激的反应，发挥抗衰老作用。

胶原蛋白是人体中无处不在的天然物质，负责维持人体的大部分结构完整性。Col I是由成纤维细胞分泌到细胞外基质（ECM）中的主要成分，占真皮的70%。它可以保持皮肤的弹性和牢固性，并作为许多人体部位的机械结构支撑，如骨骼、皮肤、肌腱、韧带和血管。它还有利于为淋巴器官的免疫反应的发展创造一个微环境。此外，它在调节生理过程中起着重要作用，如细胞粘附、增殖和分化。因此，通过两种方法验证了SBP对H₂O₂诱导的衰老HSF中Col I的合成和降解的影响。一方面证实SBP可以通过TGF-β1/Smads途径促进H₂O₂诱导的老化HSFs中Col I的合成。TGF-β1/Smads是参与胶原蛋白合成的一个代表性信号通路。TGF-β1受体可分为两种类型。TβRI和TβRII。当配体与受体结合时，TβRI和TβRII结合形成一个二聚体。

然后，TβRI被TβRII磷酸化。被激活的TβRI识别并磷酸化Smad3。磷酸化的Smad3与Smad4形成复合物，然后转移到细胞核，以促进I型procollagen的合成，这进一步促进Col I的合成。Cavinato和Jansen-Dürr等人的研究发现，UVB照射增加了细胞中的ROS数量，这反过来又减少了TβRII以下调Smad3的磷酸化，减少胶原蛋白的合成。因此发现SBP能恢复因ROS异常增加而下调的TGF-β1的表达。SBP也刺激了Smad3的磷酸化，但同时发现低剂量的SBP对Smad3的磷酸化的影响并不明显。尽管低剂量SBP对Smad3磷酸化的影响不明显，但这一结果与通过免疫荧光染色对衰老HSF中Col I含量的定量测定是一致的。因此可以得出结论，SBP对衰老细胞中Col I的合成有积极的影响，并且是剂量依赖性的。

SBP是否影响Col I的降解呢？MMPs是一个多基因的金属依赖性内肽酶家族，在涉及细胞分化、增殖、凋亡、血管生成和伤口愈合的正常生理和病理过程中发挥着重要而多样的作用。此外，它们还可以调节其他蛋白酶、生长因子、细胞因子以及细胞表面配体和受体的活性。MMPs的表达活性受MAPK信号通路的影响，并受TIMP的抑制。MAPK信号传导途径包括三个关键蛋白。ERK、JNK和p38。磷酸化的MAPK蛋白可以上调c-Fos和c-Jun的表达，并诱导活化蛋白1（AP-1）的激活。被激活的AP-1作为一个核转录因子，与MMPs的启动子结合，诱导MMP基因转录。Heo和Lee等人发现，用人参种子提取物处理Hs68细胞，通过MAPK信号通路减弱了紫外线诱导的MMP-1和MMP-3的增量，从而减少胶原蛋白的降解。

由于MMPs的主要功能是降解ECM，Col I的降解是由MMP-1开始，由MMP-3继续。MMP-1和MMP-3的表达将被TIMP-1抑制。因此，MMP/TIMP系统对维持ECM结构至关重要。因此，能够操纵这些生物标志物的天然成分有助于改善细胞老化。研究发现SBP可以通过调节细胞中TIMP-1的含量（由细胞中ROS的过度增加引起）来减少MMP-1和MMP-3的数量，从而抑制衰老细胞的胶原蛋白降解。总之，SBP可以通过TGF-β1/Smads途径上调胶原蛋白的合成，通过调节MMP/TIMP系统抑制胶原蛋白的降解。因此，它能有效地防止细胞中过多的ROS导致的细胞衰老（图7）。

来源：荣格-《国际个人护理品生产商情》

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