基于双特异性抗体的细胞系开发的基本思路

双特异性抗体（BsAb）是一类快速增长的分子，由于它们具有同时结合两种独立的抗原（或同一抗原的不同表位）的独特能力，因此提供了新的治疗前景。BsAb 也因其可以针对多种途径，而具有降低治疗耐药性的潜力。

双特异性抗体的创新双特异性开启了一系列的应用，以满足患者目前未得到满足的需求。据估计，到2028年，双特异性抗体治疗市场将以每年两位数的速度增长，全球双特异性抗体市场将超过250亿美元。此外，显著的行业趋势和机会（例如癌症和慢性病病例的增加和有利政策）继续有力地推动相关市场的增长。

然而，由于控制先进的生物治疗药物的复杂性，该行业仍然面临着一些挑战，包括难以保持亲本mAbs的亲和力和可制造性差。此外，由于旋孔KiH BsAbs是由两条不同的重链和轻链（或两条不同的重链和共同的轻链）组成，在其组装过程中可能出现多种最终形式。重链和轻链的错配可能导致不需要的杂质，这些杂质由于与理想的形式相似而难以去除。因此，以商业化为目的，持续生产结构复杂的分子，并表现出高产量和高纯度，需要敏锐的专业知识和经验。

高效促进异质性

异二聚体的形成根源于对表现出最小损失的良好分子的选择。为了确保选择高质量的分子，分析测试必须在过程的早期进行，并在此后定期应用，以减少在工艺向商业化扩展时出现意外并发症的风险。

图1. 三星生物使用两个载体和两个选择标记进行双特异性抗体开发，
图中右侧的图片（案例A 和案例B）代表了利用这种方法的两个实际案例

图2. 三星生物的下游纯度案例研究，案例A 和案例B 是图1 中参考的相同案例

为表达客户分子通常需要的三条或四条链，三星生物产品使用了一个双向量、双选择标记系统（图1） ，使重链和轻链的强正交配对，以确保形成所需的多条链。两条重链应连接在一起，两条不同的轻链应分别与两条重链结合。

三星生物产品采用了常用的 KiH 技术，以避免两条重链（HC-HC）之间产生错配。同时采取了较少见的步骤，在抗体的片段抗原结合（Fab）区域引入 CH3二聚体，以避免错配和重链（HC-LC）之间的异源二聚体轻链。错配可能导致杂质问题，这对下游净化提出了进一步的挑战。为了减轻下游的负担，建议在上游阶段进行优化，例如在分子设计和细胞系发展阶段。

其他技术，如二硫键或TCR恒定域，有可能遗漏对错配造成的杂质的检测：两条不同的链可能相连，但因为分子量将是相同的，研究人员将无法确定配对是否正确。寻求的分子类型是具有两条重链和两条不同轻链的BsAb将具有特定的分子量，而杂质很容易区分，因其具有不同的分子量，得以取得领先的纯度和产量的（图2和图3）。

图3. 三星生物的下游产量案例研究。案例A 和案例B 是图1中参考的相同案例

案例中制备了50㎍ 完全纯化的样品在非还原和还原条件下进行CE-SDS分析。CE-SDS电泳图显示，超过95%的链组合处于正确的异二聚体形成状态（图4）。

图4 - 三星生物公司的双特异性抗体的吸光度，
由非还原性和还原性CE-SDS 电泳图表征，描述案例与图1-3 中不同

及早与经常进行质量检测

三星生物利用瞬态转染寻找最有利于异源二聚体形成的矢量比。使用多种载体比率的瞬态转染材料进行质量分析（CE-SDS 或 SDS-PAGE、 SE-HPLC）。根据质素分析结果，在进入稳定细胞系开发（CLD）之前，确定达到正确的重链和轻链匹配的最高实例的载体比例。

在CLD期间的早期质量测试表明，只要在池阶段筛选，就能形成可接受的异构体水平。从这一点上看，必要的筛选减少了下游，因为分子的质量产生可行的双特异性的最关键因素已经被确认。

池筛选阶段从1,920个池开始，然后缩小到192个池，然后是96个池，在这一阶段进行相同的分析测试。然后这些基因库被缩小到5到10个克隆候选基因，用于单细胞克隆敏殖。在克隆筛选过程中进行相同的分析测试，以选择具有正确装配的高滴度克隆，从中得出客户的整个系列。

从一开始就考虑商业化

从开发之初就考量商业化，通常意味着保持对两个重要因素的认识——滴定度和蛋白质质量。关于质量，尽早测试池筛选步骤允许准确的第一次测量。在适当的考虑和相关专业知识的辅助下，早期测试有助于生物产品开发人员规划、缓解和解决开放元素。

与此同时，低滴度会显著影响产品销售成本（COGS） ，因其会推高生产所需产品所需的原材料数量，并破坏批次间的一致性。通常，三星生物能够收集到纯度超过95%的3克/升至5克/升的产品，在细胞系开发、工艺开发和制造过程中将风险降到最低。

尽管如此，由于一些分子在放大过程中遇到了问题，三星生物公司通过渐进的方式消除了放大的风险，在执行1000L的规模运行之前，先从2L的运行和100L的运行开始。如果在任何一次运行中发现问题，在推进到下一个规模之前，将进行全面测试以缓解问题。此外，用于小批量和大批量的设备，包括能够快速识别高表达克隆的伯克利灯塔®克隆选择系统和能够为细胞系选择最佳细胞培养条件的Ambr15系统都是一致的，确保小批量产品准确地代表生产结果。

结语

生成BsAb是抗体治疗史上最具创新性的领域之一。BsAb的双重特异性开启了广泛的应用，包括将T细胞重定向到肿瘤细胞，同时阻断两种不同的信号传导途径，对不同的疾病介质进行双重定位，以及将有效载荷运送到目标部位。

尽管潜力巨大，但由于存在BsAb特有的副产品--包括错配、不希望出现的片段和更高水平的聚集物--而这些副产品在mAb细胞培养上清液中是不存在的或存在的水平较低，所以BsAb也带来了一系列独特的挑战。为这类产品创造高产量和高收益的工艺是一项复杂的工作，因而拥有一个在处理这类先进分子并为其提供策略方面具有经验和经验证的合作伙伴是非常重要的。

作者：Seahee Kim,三星生物首席科学家
翻译：Jolan xie

来源：荣格-《国际医药商情》

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