爱茉莉太平洋的动物替代实践

2018年韩国率先在化妆品领域除特殊情况以外全面禁止了动物实验，这是亚太地区动物替代的一个重要里程碑。

 

作为国际知名的韩国化妆品企业，爱茉莉太平洋更是在早于韩国法规变更前的2013年就发布公开声明废除、禁止集团内部所有不必要的动物实验标准和工作，此后的6年内在韩国国内以及国际上开展了多种形式的化妆品动物替代方法的研究及推进工作。

 

本文向我们展现了韩国化妆品动物替代的现状，国际组织和各大国际公司在动物替代方面做出的努力，以及爱茉莉太平洋最近几年里开展动物替代实验获得的经验和积累，希望为国内化妆品行业动物替代的发展提供一些可供参考的经验和教训。

 

2018年韩国《化妆品法》做出重大修订

 

第15条第2小项(禁止销售进行过动物实验的化妆品)

 

①化妆品销售责任人必须遵守「实验动物相关法律」第二条第一号的规定“禁止流通、销售进行过动物实验的化妆品和使用进行过动物实验的化妆品原料制造（包括OEM）或进口的化妆品产品”。

 

②食品药品安全处必须在努力推进动物替代实验法的开发的同时为化妆品销售责任实体实际使用动物替代实验法创造必要条件。

 

为了应对因韩国化妆品行业指导法规《化妆品法》的修订而带来行业巨变，韩国政府于10年前便在韩国食品药品安全处（Ministryof Foodand Drug Safety，以下称食药处）下设韩国动物替代方法验证中心（Korean Centerfor the Validationof Alternative Methods，以下称Ko CVAM）主导韩国动物替代方法的推广和研究工作。

 

Ko CVAM开设有英文主页nifds.go.kr/kocvamen，大家可以登录查看。Ko CVAM除了负责构建韩国国内学术界与产业界、国家研究机关与国际合作机构之间的合作体系与组织联合研究的工作之外，还具有动物替代相关的政策支持、方法验证、标准制定、国内外相关资料搜集以及技能培训等的职能。

 

 

如上表所示，Ko CVAM自成立以来主导了化妆品、药品、医疗器械等领域的法规修订。虽然已经有了较大进步，但是韩国在动物替代方法的应用上依然存在以下不足：

 

1.替代方法验证中心的运营需要更完善的法规支持；

 

2.动物替代应不仅仅局限于化妆品，应制定针对包括药品、医疗器械、医用化学物等在内的全面应用的系统化支持战略；

 

3.提高动物替代新方法的信赖度以及加深对验证工作、开展国际合作、推进国际互信互认等日常工作重要性的认识。

 

 

 

上表内记载的是经过韩国动物替代方法验证中心验证并公布的标准方法指南。

 

在韩国，除食药处之外韩国国立环境科学院、农业科学院也在针对化学物质、农药等进行替代方法方面的研究，此外保健福祉部以及情报通信部也在进行针对药品的功效评价的替代方法相关研究。

 

韩国虽然在2018年修订《化妆品》后禁止了化妆品的动物实验，但也并非完全禁止动物实验，符合以下六种情况之一则允许进行动物实验：

 

●对于制定防腐剂、色素、防晒剂等在使用上需要一定限制的原料的使用标准，或根据同条款第3项“为排除对国民健康危害风险”而需要进行化妆品原料的风险评价的情况

 

●没有动物替代实验法(指不使用动物的试验方法以及虽然不得已而使用动物，但通过减少实验动物用量或减轻实验动物痛苦的方式进行改良并得到食品药品安全处认证的试验方法。）可用，并需要进行动物实验的情况

 

●为出口化妆品而根据出口对象国法律而需要进行动物实验的情况

 

●为出口而根据对象国法令在产品开发中需要进行动物实验的情况

 

●根据其他法令需要进行动物实验的原料用于化妆品制造的情况

 

●在替代动物实验的方法较难实施的情况下得到食品药品安全处同意的情况

 

OECD等国际组织、国际公司的全力推动

 

当前化妆品产品对新原料的依赖度相对较低，而已用原料中很多已经进行过大量研究评价，因此禁止化妆品动物实验对化妆品产品安全性评价造成的风险较低。但是，由于禁止化妆品动物实验引起产品安全性评价的变化，从而对化妆品新原料开发方面产生的影响则还有待观察。动物替代方法主要有基于离体细胞、人工组织、非生物学的体外试验以及以计算机模拟运算为基础的insilico评价等类型。目前世界范围内除了各国政府、国际机构之外，大型的化工企业、化妆品企业、香精香料企业等投入了大量的人力、物力、财力对替代方法进行研究、开发、应用。其中以OECD为代表的国际机构在替代方法的开发、验证以及国际间的互信互认成绩最为瞩目。通过OECD多年的不懈努力已经在全球范围内推广了大量科学、准确、客观的动物替代方法指南。

 

 

在TT21C理论的指导下，随着AOP研究的不断深入会有越来越多、越来越准确的动物替代方法不断出现。但是新开发出的动物替代方法要最终成为可用于产品、化学品评价的认证方法需要经过方法开发、验证、改进、制定适用标准与评判标准、确定应用范围等流程。而目前已有的方法也可通过在实际运用中的不断改进和组合获得更加优秀的实用性、时效性、准确性、灵敏性等优点。

 

爱茉莉太平洋的实践分享

 

以下就是爱茉莉太平洋近年来在动物替代方法研究上的一些实践应用。

 

I.人角膜细胞测试（Humancornealcell(HEC-T)test）是将已有的短时暴露方法（short time exposure test）中的兔眼角膜细胞系更换为人角膜细胞改良而来的评价方法。待测物质以3个浓度处理人角膜细胞1小时后，根据细胞活率进行评分，将各项评分相加得到眼刺激指数，以6分为临界将待测物质分辨为刺激性或非刺激性。通过测试，发现基于眼刺激指数（Total eye irritatin score）的该方法具有80%以上的灵敏度以及较高的相关性。

 

II.DPRA方法相比于用于化妆品产品检测则更适合用于化妆品原料评价。本方法的原理简单来说就是将未与待测物质发生反应的赖氨酸、半胱氨酸多肽进行染色，通过HPLC检测，确定多肽的反应减少量而对致敏作用进行评价的方法。

 

 

但是现有DPRA方法在使用HPLC进行测定时较为繁琐，因此经改良后可使用紫外分光光度仪或酶标仪进行检测。将使用HPLC检测的方法与使用酶标仪测定的方法进行比较的话，使用酶标仪进行检测的方法具有分析过程较快且较简便、测试极限用量较低、有利于进行浓度研究等特点；而HPLC方法则可以得到精确的数据，但具有耗时长、需要较高熟练度等缺点。当然改良方法也存在因为待测物质的干扰导致吸光度数据不准确、不适用于溶解度低的物质等缺点有待完善。

 

III.前面提到使用人体角膜细胞进行眼刺激性评价的方法，但是鸡胚绒毛尿囊膜测试（HET-CAM）是实际目前为替代残忍的兔眼试验而应用最多的替代方法。虽然最近学术上有使用鸡胚胎是否属于动物实验的争论，同时还存在对实验人员主观判断的高度依赖性等急需改进的问题，但是作为一个经过长时间和大量应用的可替代动物试验的方法，相比于其他新开发的替代方法也具有相对较为稳定的优点。

 

为了改进鸡胚绒毛尿囊膜试验（HETCAM）我们做了以下尝试：

 

1).为了改进鸡胚试验受实验人员主观判断影响较大的问题，尝试了用台盼兰染液对绒毛尿囊膜进行染色后用甲酰胺处理3分钟，将台盼兰染液洗脱并在595nm处测取吸光度的方法。结果显示：虽然存在相关性较大的被测物质数据，但是也存在由于强刺激导致尿囊膜严重损伤最终染色无法进行的问题。

 

2).为了更准确地检测含有挥发性成分的产品或原料的眼刺激性，尝试使用一面具有吸附性而背面被箔的新型材料，在吸附定量的待测产品或原料后覆盖在尿囊膜上方，模拟出一个仅对绒毛尿囊膜暴露的挥发环境，结果表明：相比于原方法，改进后与挥发性物质显示出更好的相关性。

 

IV.目前光毒性动物替代实验法使用的是OECD guide line432的方法，但该方法在OECD指南中虽未明确规定阳性对照氯丙嗪处理浓度，但最终结果必须满足标准规定IC50范围的要求，实际应用中时常发生500ug/mL的氯丙嗪无法满足OECD指南中要求的IC50值而需要重新进行测试的情况。为了解决这个问题、提高检测合格率，使用一系列浓度的氯丙嗪进行试验，结果显示最大用125ug/mL的氯丙嗪可满足紫外照射和无紫外照射条件下指南的要求。

 

V.在皮肤致敏性研究中，利用THP-1细胞的CD54与CD86作为生物标记计算RFI值对各待测物质的多种浓度进行了比较研究，通过结果可以看到以CD54和CD86为生物标记很好的重现致敏原与致敏代表反应之间高度灵敏的相关性，证实了该方法对致敏性物质以及变态反应抑制物进行判定的可行性。此后利用作为代表性致敏物质的染发剂PDD处理诱导CD54和CD86表达量升高，通过评价植物提取物对生物标记物CD54和CD86表达量的下调来评价植物提取物对变态反应的缓解、改善功效。结果显示：通过该植物提取物的处理，CD54/CD86表达量明显下调，表明该植物提取物可能具有改善、缓解变态反应潜在功效。

 

VI.相似地，由于甘露糖赤藓糖醇脂（Mannosylerythritolipid）具有和神经酰胺相似的结构，爱茉莉太平洋曾就甘露糖赤藓糖醇脂修复SLS造成的细胞损伤的功效利用动物替代方法进行了研究并发表了论文。爱茉莉太平洋进行的研究则是对甘露糖赤藓糖进行包覆的保湿粉彩妆产品进行了评价，通过使用SLS对人工皮肤模型进行处理，造成了皮肤细胞膜磷脂层损伤。在使用该彩妆产品进行长时间处理后修复了细胞膜磷脂层损伤，提高了细胞活率，同时证明了化妆品功效一样可以使用动物替代方法进行评价。

 

VII．爱茉莉太平洋利用人工口腔黏膜模型对牙膏进行安全性评价，切片所示可观察到黏膜细胞的核凝结与组织损伤，以及证明了根据细胞活率以及IL-1α评价牙膏安全性的可行性。

 

 

如上所述虽然已经有很多动物替代方法评价模型可用于评价，但是单一方法始终存在一定的局限性。比如，当评价具有复杂生物学过程的致敏反应时，利用单一动物替代方法可能不足以充分证明变态反应是否发生。目前学术界普遍认为单一动物替代方法很难进行准确的评价，同时由于各个动物替代方法都具有更善于判定阳性物质或阴性物质的特点，根据这些特点将多种方法结合起来进行评价则有利于做出更为准确的预判，所以需要使用结合不同机制或不同灵敏度的其他方法进行评价的ITS接近法。更详细地来说，既有分阶段进行评价的情况，也有综合实验结果进行综合判定的情况。

 

例如，爱茉莉太平洋曾基于DPRA、基于ARE-Nrf2通路的荧光测试、h-CLAT三种方法对39种标准物质进行试验，尝试使用两种接近法寻找分类能力最好的方法组合。

 

在本项研究中：

 

●ITS-1是将以DPRA和ARE-Nrf2荧光测试为第一阶段，将结果不一致的物质用h-CLAT进行最终评价的方法

 

●ITS-2则是在DPRA和ARE-Nrf2荧光测试的结果不一致或阴性时，使用h-CLAT进行重复验证的方法

 

 

结果显示ITS-1和ITS-2方法各表现出82%和90%的准确率；相比ITS-1，ITS-2具有92%的较高阴性物质分类准确率。

 

目前为了解决类似皮肤变态反应此类具有复杂生物学进程的毒性反应的评价难题，同时提高预判准确性，宝洁、奇华顿、欧莱雅、资生堂、巴斯夫等众多企业均在开发独有的ITS接近法。其中巴斯夫和奇华顿已经公布了对比人体临床结果各具有90%和92.7%极高准确率的ITS接近法

 

爱茉莉太平洋在中国的化妆品动物替代

 

研究工作爱茉莉太平洋上海研发中心作为爱茉莉太平洋集团海外最大的研究分支机构，基于中国化妆品动物替代法律进程，与爱茉莉太平洋总部联合进行了一系列动物替代方法研究。目前上海研发中心主要将精力集中在构建符合中国国情的、可用于直接检测化妆品产品皮肤刺激性、眼刺激性以及各项功效测试的内部SOP上，同时通过与国内优秀的动物替代研究机构间的合作开发具有中国特色的独创性方法，以及通过作为国际企业研发中心的优势促进国内外机构间的合作和交流。

 

总结

 

目前动物替代法更多地用于原料的安全性评价，已开发有多样的试验方法，在未来如何提高评价作为混合物的化妆品产品以及包括皮肤变态反应等在内的具有复杂生物学反应的评价准确性是化妆品动物替代方法发展的一个重要课题。同时动物替代方法作为较新的研究领域，在一面努力开发新方法的同时也应该不断发掘已有方法的潜力，充分理解方法开发与应用之间的环境差异，在研究中应该针对研究方向与目标有的放矢地进行调整。

 

 

作为一家化妆品终产品的生产企业，爱茉莉太平洋基于自身战略和目标，从与动物替代研究最前沿的众多研究机构不同的视角出发，将不断加大对动物替代事业的投入，努力促进化妆品行业动物替代的发展和完善。