以 ELISA 方法检测食物过敏原

未申报的食品过敏原是一种潜在的重大食品安全危害，制造商需要采取措施、流程和控制方法，以防止未申报的主要食品过敏原出现在其产品中。食品过敏原残留的检测和定量是食品过敏原控制的一项重要事宜，能够检测和定量食品中过敏原蛋白的方法有多种方式。食品制造商可以使用过敏原检测方法来评估过敏原控制计划的各个方面，包括清洁程序、供应链控制和总体过敏原管理。此外，制造商可能需要依赖食品过敏原检测方法来确认产品中是否存在未申报的食品过敏原，并进行根本原因分析。食品过敏原检测方法也被监管部门用于调查市场上的产品中是否存在未申报的主要食品过敏原，无论是作为研究的一部分，还是作为执法行为的一部分。

 

了解食品过敏原检测方法是如何工作的，如何为特定的应用选择合适的检测方法，如何解释这些检测方法的结果，以及这些检测方法可能带来的潜在问题，对于食品制造商在实施过敏原控制计划或应对潜在的过敏原召回时至关重要。

 

 

检测方法的工作原理

 

目前，食品成品中过敏原的检测和定量主要采用酶联免疫吸附测定法（简称酶联免疫法，或者ELISA法）。ELISA通过特异性识别感兴趣的食物蛋白抗体来检测来自过敏食物的蛋白质。方法开发人员将这些过敏原特异性抗体暴露在实验动物的食物或蛋白质标靶上，从而产生这些抗体。在产生免疫反应后，可以收集抗体，筛选特异性和亲和力，然后在ELISA测试中使用。

 

食物过敏原检测大多使用ELISA夹心法。在ELISA夹心法中，将一种过敏原特异性抗体来源涂覆在微孔表面上，通常为96孔板形式。在用抗体（也称为捕获抗体）包被后，用封闭剂包被微孔以防止组分与样品的任何非特异性结合。在商业过敏原ELISA试剂盒中，会提供预包被和封闭的微孔作为试剂盒的试剂之一。

 

当进行ELISA夹心法时，将来自目标样品或方法对照品中提取的提取物依次添加到单个微孔中。在潜伏期内，目标过敏性食物样本中的任何蛋白质都会与微孔表面的抗体结合。蛋白质上抗体识别区域称为抗原表位。

 

之后，将微孔彻底洗涤以除去任何未结合的样品组分。然后将第二种过敏原特异性抗体加入微孔中，并与已经捕获在微孔中的靶蛋白结合，形成抗体夹心，中间为靶蛋白。在商业试验中，这种第二抗体将有一个酶附着（或偶联）到它上面，因此，第二抗体通常被称为偶联抗体。在另一个洗涤步骤中除去未结合的偶联抗体后，将偶联酶的底物添加到孔中。存在于微孔中的酶将基质转化为特定的颜色产物，表明存在完整的抗体夹心，并因此存在食物过敏原靶标。

 

微孔中产生的颜色量取决于酶的数量，而酶的数量又取决于目标过敏原蛋白的数量。颜色强度和目标变应原蛋白量之间的关系，可以用来量化样本中目标变应原的量。

 

为了得到定量的结果，在分析样品的同时，还分析了一系列含有已知数量的致敏食品蛋白的标准。标准品和样品的吸光度值都是用读板器测量的。当从标准中提取的吸光度值与已知浓度作图时，就可以得到一条标准曲线（见图1）。

 

 

ELISA方法结果解读

 

如何解读食物过敏原ELISA方法的结果可能是一个挑战，因为许多不同的因素可以影响方法的结果输出。

 

单位和校准器。大多数商业食品过敏原ELISA报告的结果浓度范围为百万分之一（ppm）。ppm的单位表示分析物的浓度值，也可以表示为每千克产品的mg分析物（mg/kg）。然而，仅仅使用ppm或mg/kg的单位并不能为食物过敏原ELISAs提供足够的信息。同样重要的是要明确知道单位是用什么形式的分析物表示的。食品过敏原ELISA最常见的分析单位是整个商品（如ppm花生、核桃、鸡蛋等）或总蛋白（如ppm花生蛋白、核桃蛋白、鸡蛋蛋白等）。然而，对于某些食品，有些商业化的ELISA试剂盒，可以根据过敏食品的可溶性蛋白或单一蛋白分析物（如ppm-乳球蛋白）表达结果。为了理解ELISA结果的含义并比较不同ELISA方法的结果，关键是要表达完整的单位。用不同单位的方法分析同一样品，即使其他方法条件相同，定量结果也会有很大差异。

 

检测限、定量限、适用下限。与许多检测和定量方法一样，食品过敏原ELISA只能在目标分析物浓度的一定范围内工作。当浓度低于某一方法无法区分真阳性和真阴性时，就称为检测限（LOD）。因此，检测方法的LOD控制了由食物基质引起的假阳性，通常使用空白基质的统计评估来进行估计。因为食物过敏原ELISA的LOD高度依赖于所分析的特定背景食物的基质，所以它可能不像其他方法指标那样适用于各种食品和成分。

 

定量限（LOQ）是可以以特定精确度量化分析物的最低水平（即，具有特定的变异系数，通常为10%CV）的一种方法。通过统计计算确定的LOQ也依赖于背景基质，并且可能不能表示方法在不同食物基质上的性能。因此，方法开发人员可以设置一个较低的适用性限制，更好地将方法的性能表示为LOQ，并通过将其包含为标准曲线上的最低正值来确定该水平。

 

选择合适的方法

 

在选择食物过敏原ELISA方法时，需要考虑的主要因素之一是该方法是否检测到需要考虑的过敏原源成分。检测过敏原来源成分的能力取决于许多因素。应该了解的第一个方法特性，是该方法针对的是什么蛋白质或蛋白质组——对于过敏性食品尤其重要，食品工业从这些食品中生产含有不同蛋白质组分的成分。

 

这个问题的典型例子是检测牛奶残留物。食品工业生产和利用由不同乳蛋白组分组成的成分，特别是乳清蛋白和酪蛋白蛋白组分，这两种成分都对过敏消费者构成风险。然而，牛奶过敏原的ELISA检测，经常被用来识别特定蛋白质（例如，乳清组分中的β-乳球蛋白或酪蛋白组分中的αs1酪蛋白）或蛋白质组分（例如，酪蛋白）。

 

如果牛奶过敏原交叉接触是由于乳清分离蛋白成分引起的，则使用针对酪蛋白的方法进行评估或验证将是无效的，因为酪蛋白在乳清分离蛋白成分中的含量极低（如果有的话）。当交叉接触源是酪蛋白酸钠成分时，情况正好相反，在这种情况下，使用β-乳球蛋白ELISA检测将不起作用。除了了解ELISA的目标外，了解过敏原来源的成分是否经过加工处理也很重要，这可能会影响检测结果。

 

在某些情况下，ELISA方法的特异性也应作为一个考虑因素。大多数食物过敏原ELISA对感兴趣的目标过敏食物具有极高的特异性。但在某些情况下，非常密切相关的食物可能与ELISA方法中使用的抗体发生交叉反应。在密切相关的致敏食物，如核桃和山核桃中，能够观察到这种类型的交叉反应问题。在被指定为主要过敏原的食物（如花生）和未被指定为主要过敏原的相关食物（如豌豆）之间，也可以观察到交叉反应。

 

在大多数情况下，商业ELISA开发人员已经在开发过程中筛选了与密切相关物种的交叉反应性，应该能够向用户提供有关检测特异性的信息。如果在产品中使用与主要过敏源食品密切相关的新食品成分，在评估成品之前，最好对这些成分的潜在交叉反应性进行评估。

 

ELISA中潜在的食物过敏原问题

 

虽然食品过敏原ELISA法在许多情况下提供高质量的定量数据，具有足够的敏感性和特异性，但在某些情况下，ELISA方法面临着特定的挑战。

 

热处理。热处理（例如，干馏、油炸、UHT）会影响ELISA方法检测和定量一些过敏原食物的能力。热处理的效果是双重的。首先，热处理可以使食物蛋白质变性，降低ELISA抗体识别蛋白质的能力。然而，这些变性食物蛋白仍然被认为是过敏原。

 

热处理的第二个影响是它可能导致靶蛋白聚集，使得它们不能通过典型的ELISA提取方法提取。如果目标蛋白没有被提取出来，它们就不会被包含在检测中，也不会被检测出来。与变性相似，聚集和不溶性蛋白质仍应被视为过敏原。

 

发酵和水解过程。发酵等可能导致蛋白质部分水解的过程也会对ELISA定量产生不利影响。在这些情况下，部分水解可能导致检测抗体识别的部分蛋白裂解。虽然存在广泛水解可以降低变应原性的情况（例如，广泛水解的婴儿配方食品或酸水解的植物蛋白），但是不可能使用ELISA方法确定变应原性。对于通常针对完整蛋白质或大肽的ELISA夹心法尤其如此，其中仅一部分蛋白质的水解可以阻止检测，因为形成抗体夹心所需的两个单独识别区域可能无法保持连接，即使其他大块蛋白质保持完整。