日本化妆品科研新动向― 关注表皮细胞自噬活性的美白技术开发

所谓AUTOPHAGY，正如被译为自噬作用一样，是指细胞通过溶酶体（Lysosome）分解﹑消化自己一部分的现象，通过分解细胞质成分、不断代谢周转进行细胞内的净化。其功能的下降与癌症、神经变性疾患、感染性疾患、心血管疾患、代谢疾患、肺疾患等各种疾病有相关性1)。另有报道指出表皮细胞的自噬功能与表皮的分化、黑色素代谢、免疫应答、抗菌（抗感染）、抗压等有关2)。自噬功能一旦下降，细胞内就会蓄积异常蛋白质及功能不全的线粒体，成为老化的原因。

自2016年大隅善典教授因自噬方面的研究获得诺贝尔生理学或医学奖以来，以自噬为出发点的研发更加受到关注。在化妆品研发方面，从皮肤抗老化观点出发，对自噬的关注度也很高。近年来各原料厂商也开发了很多的自噬活性促进剂。本文以花王公司村濑先生等人的论文3)对表皮细胞的自噬活性和肤色（黑色素代谢）的概述为基础，就关注表皮细胞自噬活性的美白技术开发方向进行论述。作为该论文作者之一的大阪大学吉森保教授，正是大隅教授门下从事自噬研究的第一人。

自噬（Autophagy）

自噬虽有4种通路（巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬、分泌吞噬），单纯说自噬一般指的是巨自噬。即由内质网内生成的双层膜构成的隔离膜包裹吸收部分细胞质成为自噬体、自噬体与带有加水分解酶的溶酶体融合形成自噬溶酶体、消化内含物质（图1）。

图1. 自噬的流程

调查自噬活性的方法有定量自噬体的数量的方法和定量自噬flux（自噬的通量）的方法。自噬体的数量可根据其形态特征（双层膜）用电子显微镜调查，或者把是自噬体的标记的LC3 (microtubule-associated protein 1light chain 3) 免疫染色后用荧光显微镜观察、计算辉点。LC3是自噬体的标记的同时，也是通过自噬被分解的基质。因此， LC3的分解量可以成为自噬通量的指标。LC3在细胞质中合成后，被半胱氨酸蛋白酶切断一部分后成为LC3-Ⅰ，与是自噬体的膜构成成分的磷脂酰乙醇胺结合成为LC3-Ⅱ。自噬体一旦与溶酶体融合LC3-Ⅱ就会被分解。但是，由于如果使用溶酶体阻碍剂处理，LC3-Ⅱ就不会被分解地蓄积下来，所以添加了阻碍剂的样品和未添加的样品的LC3-Ⅱ的差值就可以认为是因自噬被分解的LC3-Ⅱ量、即自噬通量的指标。另外，由于p62与LC3结合，变成自噬的基质， p62也同样是自噬通量的指标。

由于不能辨别是因自噬衍生而使自噬体增加了还是自噬的最终分解阶段被阻碍而使自噬体增加了，调查自噬的活性大多是通过求取自噬通量。

在色素细胞（黑色素细胞）生成的黑色素小体在转移到表皮细胞（角化细胞）后，被溶酶体分解把角质形成细胞(NHEK) 和黑色素小体（由MNT-1黑素瘤细胞单独分离）一起培养后，回收角质形成细胞，调查细胞内的黑色素量及黑色素小体量（使用PMEL17抗体通过蛋白质印迹法测定）。一旦使用溶酶体阻碍剂(E64-D及Pepstatin A)，黑色素的增加及黑色素小体的蓄积随着用量增加而上升。使用白种人的角质形成细胞和黑种人的角质形成细胞调查黑色素小体的包裹吸收情况，结果虽然吸收量（24小时内）没有差异，但角质形成细胞中的黑色素量和黑色素小体量都是白种人较少、黑种人较多。这些结果说明：白种人和黑种人角质形成细胞的黑色素小体分解能力不同。

角质形成细胞的自噬与黑色素小体的分解大有关联

由于已经知道了在角质形成细胞中黑色素小体的分解通过溶酶体而加快，这里就对溶酶体有关的自噬的作用进行了调查。把用siRNA抑制了自噬关联蛋白7 (ATG7) 表达的角质形成细胞（阻碍了自噬的细胞）和黑色素小体一起培养，调查PMEL17（黑色素小体的指标）和LC3-Ⅱ（自噬体的指标）的举动。一旦阻碍了自噬，LC3-Ⅱ就会减少、PMEL17及黑色素量均增加了，这就说明在角质形成细胞中自噬与黑色素的分解有关联。把角质形成细胞和黑色素细胞共同培养，用PMEL17抗体染色黑色素小体、用LC3抗体染色自噬体，通过荧光显微镜观察可以看到黑色素小体被自噬体包裹吸收的情况（图2）。

图2. 角质形成细胞中的自噬体和黑色素小体

另一方面，一旦用siRNA阻碍黑色素细胞的ATG7表达，黑色素细胞中的黑色素、黑色素小体均减少了，显示了不同于角质形成细胞的情况下的举动。

与黑种人相比，白种人的角质形成细胞中的自噬活性更高

对角质形成细胞培养体系（白种人及黑种人）使用自噬阻碍剂（羟化氯喹、HCQ: hydroxychloroquine。阻碍自噬溶酶体的功能），通过蛋白质印迹法调查LC3-Ⅱ 及p62的表达，与未添加的情况下相比较求取自噬通量。通过使用HCQ，白种人和黑种人的LC3-Ⅱ、p62均上升了。通过与未添加（对照样）之间的差值（这里用的是比值）求取自噬通量，可以发现：与黑种人相比，白种人的自噬通量更高、自噬活性更高（图3）。

图３. 自噬活性的比较
 

自噬与决定肤色本质相关

在三维皮肤模型 (3D-HSSs) 上使用自噬活性剂（雷帕霉素及维拉帕米），黑色素量减少、皮肤模型的颜色变亮了。确认了通过自噬的活性化，LC3-Ⅱ增加、p62蛋白减少。而使用自噬阻碍剂(HCQ) 后，p62, LC3-Ⅱ增加、颜色黑化了。

在培养了黑种人的皮肤组织进行的ex vivo实验中，同样地，通过使用雷帕霉素及维拉帕米，黑色素量降低、皮肤的亮度(L*) 上升了。而通过使用羟化氯喹，黑色素增加、L* 下降了。

展望

在黑色素细胞生成的黑色素小体（黑色素）被传输到角质形成细胞、最终作为污垢从皮肤脱落，很多美白剂都是以这一过程为研究对象开发的。例如：抑制因紫外线在表皮生成的ROS的作用的物质、抑制由角质形成细胞发出的活化黑色素细胞的信号的物质、抑制黑色素细胞中黑色素生成的物质、抑制黑色素小体的传输的物质、为了使富含黑色素颗粒的角质形成细胞尽快脱离的表皮周转促进剂等，开发了各种各样的物质。在这样的研究趋势下，该研究提出了关于肤色决定（色素沉积）的新机理（角质形成细胞中的黑色素的分解）。目前，有报告提到：与黯淡的皮肤（Phototype Ⅳ及Ⅴ）相比，明亮的肌肤（PhototypeⅠ及Ⅱ）的表皮上有更多的组织蛋白酶V/L2（存在于溶酶体）、活性也更高4),5)。利用自噬活性原理开发的新美白剂在效果上与已有的成分有多大的差异，让人非常感兴趣。这次聚焦了自噬与肤色的关系，其实自噬与皮肤老化也密切相关﹑有很多研究，下次将就这方面进行介绍。

参考文献：

1) KR Parzych, DJ Kionsky, An overview of autophagy, mechanism, and regulation. Antiox Redox Signal, 2014, 20:460-473  

2) Li Li, Xu Chen, and Heng Gu, The signaling involved in autophagy machinery in keratinocytes and therapeutic approaches for skin diseases.

Oncotarget, 2016, 7:50682-50697

3) D. Murase, A Hachiya, K Takano, R Hicks, MO Vissche, T Kitahara, T Hase, Y Takema, and T Yoshimori, Autophagy has a significant role in determining skin color by regulating melanosome degradation in keratinocytes. J Invest Dermatol, 2013, 133:2416-2434

4) N Chen, M Seibeg and CB Lin, Cathepsin L2 levels inversely correlate with skin color. J Invest Dermatol, 2006, 126:2345-2347    
   
5) JP Ebanks, A Koshoffer, RR Wickett, T Hakozaki, RE Boissy, Hydrolytic enzymes of the interfollicular epidermis differ in expression and correlate with the phenotypic difference observed between light and dark skin. J Dermatol, 2013, 40:27-33