一次加菌和三次加菌的防腐效能研究

化妆品在生产和使用过程中极易受到微生物的污染，因此化妆品需要提前做好防腐性能测试，而化妆品防腐剂的防腐效能一般通过微生物防腐挑战性实验进行评定。

目前国内外使用的防腐效能评价方法有很多，包括：欧洲药典EP 5.0(5.1.3微生物防腐功效)、美国药典USP 39〈51〉微生物防腐功效测试、英国药典BP附录XVIC(C5.1.3)微生物防腐功效、CTFA M-3(2001)水溶性化妆品防腐功效测试、ASTM E640-2006水溶性化妆品防腐测试方法等。按照微生物防腐挑战性实验的接菌方式分类，可分为一次加菌方法和重复三次加菌方法。

本文参考美国药典 ( 第39版) 一次加菌防腐挑战性试验和CTFA推荐的重复三次加菌防腐挑战性实验，在对生产过程的微生物进行严格控制的情况下，研究了一次加菌的28天微生物挑战性实验方法和重复三次加菌的42天微生物挑战性实验方法在不同化妆品类型（贴布式面膜和润肤乳）中的应用。

实验方法

一次加菌的28天微生物挑战性实验

此方法参照美国药典(第39版)上微生物挑战性测试，称取各受试样品30g于灭菌的样品瓶中，加入定量的混合菌悬液, 要求样品中的细菌初始加菌浓度为1.0×105-106cfu/g；酵母和霉菌初始加菌浓度为1.0×104-105cfu/g。然后充分混匀, 用封口胶封好样品瓶口，置于28℃左右的培养箱中。在接菌的7、14、21和28天取样分析。

评价标准：

（1）细菌总数从初始到第7天的细菌数对数减少值不能小于1.0；细菌总数从初始到第14天的细菌数对数减少值不能小于3.0；并且从14天到28天细菌数不增加。

（2）霉菌和酵母菌总数从初始到7天、14天和28天，霉菌和酵母菌总数不增加。

重复三次加菌的42天微生物挑战性实验

重复3次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g，每隔1周加菌一次( 即实验的第1、3和5周)，每次加细菌量为1×106～1×107cfu/g样品和霉菌1×105～1×106 cfu/g样品。在加菌后的0天、7天和14天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。

评价标准：此方法可将受检样品分为三类:

(1) 防腐效果优良(W)，即三次加菌后，在每次加菌后的第7天或14天时，存活菌量减少至不高于起始浓度的0.01% ( 即≤100个/g或ml）样品，通过测试)。

(2) 防腐效果尚可(M)，即三次加菌后，在每次加菌后的第7天或14天时，存活菌量减少至不高于起始浓度的0.1%，
( 即≤1000个/g或mL样品，通过测试)。

(3) 防腐效果差(P)，即三次加菌后，在每次加菌后的第7天或14天时，存活菌量>起始浓度的0.01% (不通过测试)。

实验材料

培养基

细菌：卵磷酯-吐温80营养琼脂培养基

酵母菌和霉菌：孟加拉红（虎红）琼脂培养基

生理盐水

称取8.5gNaCl溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌20min，待用；

试验菌株

测试用标准菌株：

大肠杆菌（Escherichia Coli），ATCC  8739

绿脓杆菌（Pseudomonas Aeruginosa），ATCC  9027

金黄色葡萄球菌（Staphy Lo Coccus Aureus），ATCC 6538

白色假丝酵母（Candida Albicans），ATCC 10231

黑曲霉（Aspergiblus Niger），ATCC 16404

环境菌：

洋葱伯克霍尔德氏菌( Burkholderia cepacia ,BC)，ATCC 25416

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，ATCC 17485等

实验过程

混合菌悬液的制备

参考麦氏比浊法配好标准麦氏比浊管，轻摇标准试管。无菌操作下，将活化好的各个菌种加入无菌生理盐水（0.85% NaCl），分别稀释到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中。以无菌操作下被测定试管加入无菌生理盐水（0.85% NaCl），直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。将各个菌悬液定量加到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中形成混合菌悬液。将制备好的混合菌悬液取1mL菌液于含有99mL灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分混匀后，制成1：100稀释液。同样方法再从中取1 mL菌液于含有99mL灭菌生理盐水的锥形瓶中，分混匀后，制成1：104稀释液。依序再做稀释1：106；将稀释好的这几个梯度的溶液倒平板计数，最终得到每次加菌的细菌、酵母和霉菌的含菌量，若含菌量未达到或者远远超过标准加入量，则样品需重做。

接菌

称取各受试样品30g于灭菌的样品瓶中,加入1%的混合菌悬液, 然后充分混匀, 用封口胶封好样品瓶口，置于28℃左右的培养箱中。在接菌后定期取样分析。

接菌方式采用的是混合接种的方式，并且推荐在标准菌的基础下，加入生产环境菌一起进行挑战性实验，这样可以更加地模拟现实的污染情况，也符合自然界的微生物混生杂居的特点，能够给待测样品带来更佳的质量保证。

结果分析和讨论

受试样品贴布式面膜和润肤乳都含有3个防腐体系，所有样品在进行一次加菌和三次加菌之后，结果见表2-5：

从一次加菌和三次加菌的试验结果可以看出，防腐体系1-3不管是在面膜还是润肤乳中，都是能够通过一次加菌的微生物挑战性实验的，说明防腐体系1-3是能够有效防腐的；从表5中的两种方法结果评判对比可以知道，防腐体系2虽然能够通过一次加菌的挑战性实验，但其防腐效果差，所以此防腐体系被微生物污染的风险较大。而三个防腐体系中，防腐体系3不管是一次加菌还是三次加菌，都表现出很好的抑菌效果。所以三次加菌的挑战性实验相对来说会更加严格，对产品的防腐体系要求更高，同时对产品的质量更有保证，但三次加菌的实验周期长，操作和工作量也相对多。

表2  一次加菌的挑战性试验结果（cfu/g样品）

两种方法各有各的指导意义，一次加菌的28天微生物挑战性实验能够评判防腐体系是否有效抑制化妆品生产和使用过程中带来的污染；三次加菌的42天微生物挑战性实验能够对产品有效的防腐体系进行防腐能力程度分类，从防腐优良、尚可到差。两种方法结合起来可以更清楚的判断防腐体系的防腐能力，给配方工程师提供更加全面的参考。然而并不是说防腐效能越强越好，因为防腐体系能够抑菌的同时，也会给化妆品带来相应的刺激性和更高的成本。

表3  三次加菌的挑战性试验细菌结果（cfu/g样品）

工程师在选择化妆品的防腐体系时应结合实际生产和产品特性等去对防腐体系进行科学的调整。对于新产品防腐体系的测试建议需要进行两种方法的测试之后再结合配方要求和产品特性或者结合刺激性实验和斑贴实验去确定产品的防腐体系。通过对不同类型化妆品的生产工艺和产品使用特点进行研究发现，对于进行防腐体系微调或者希望短期内需要确定防腐体系的化妆品来说，可以通过以下的建议进行测试：一次性快消化妆品，建议进行一次加菌的28天微生物挑战性测试；对于重复多次使用化妆品，建议进行重复三次加菌的42天微生物挑战性测试。

表4  三次加菌的挑战性试验酵母和霉菌结果（cfu/g样品）

那么接下来看看不同类型化妆品的生产工艺和使用特点。

化妆品的种类繁多，有很多的分类方法。按照使用方式分类可分为：一次性快消化妆品和重复多次使用化妆品。一次性快消化妆品是指那些使用寿命较短，消费速度较快的消费化妆品，比如贴布式面膜和一次性湿巾等。重复多次使用化妆品比较多，指使用寿命长，日常重复使用的产品，比如日霜和乳液等。

表5  受试样品的两种微生物挑战性实验结果评判对比

湿纸巾和贴布式面膜生产过程除浸渍液/乳液制备外，还包括衬垫基质材料处理，此类产品微生物污染的危险和可能来源实质上与其他化妆品生产过程和充装过程相似。由于湿纸巾和贴布式面膜生产还包括充液，裁切和封装等工艺。在这过程中，产品与各种设备的表面直接接触，转移操作增加，这样增加了污染的可能性。成卷筒无纺织物储存也易引起污染。要使此类产品达到规定的卫生标准，生产过程和纺织物载体的微生物控制显得更为重要。

因一次性快消化妆品使用寿命短，开封用完即可。而重复多次使用的产品需要重复使用，即每次开盖使用都会带来二次污染，包括手部和空气中的菌。

一组关于手指残留菌数的研究，结果如下：

表1  手指残留菌数

由上可知，在使用过程中，重复多次使用的产品相较一次性快消品来说，被重复污染的情况更为严重。而在生产过程中，贴布式面膜和湿纸巾等产品相较重复多次使用的产品来说，操作工序需有更加严格的质控措施，尤其是无纺织物载体需要彻底进行消毒杀菌。因此在对生产过程的微生物进行严格控制的情况下，对于重复多次使用的产品来说，防腐体系应具有更好的抑菌性能，以及应提前做好防腐体系的防腐效能测试。而一次性快消化妆品在做好生产过程和纺织物载体微生物控制的基础上，防腐体系不应过强，尽量减少过敏率，特别是市场上过敏率较高产品之一的贴布式面膜，更应把握好防腐效能和刺激性之间的平衡。

而一次加菌和重复三次加菌两种方法能够给工程师根据不同的配方要求和产品使用特点进行选择性的测试，选择出更合适的防腐体系。微生物无孔不入，建议化妆品在大生产之前应提前做好防腐效能测试，以及模拟生产整个过程进行小试的成品也应进行相应的微生物挑战性测试之后，再进行大批量生产。

对于防腐体系微调或者短期内需要确定防腐体系的一次性快消产品，建议进行一次加菌的28天微生物挑战性测试；而重复多次使用化妆品，建议进行重复三次加菌的42天微生物挑战性测试。

附：实验室无菌操作技术

无菌操作技术是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

无菌操作技术主要包括两方面，一是创造无菌的培养环境，包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；二是在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施，包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

无菌操作原则：

1. 在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；

2. 在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；

3. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；

4. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

5. 接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；

6. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

无菌操作的环境要求

1. 无菌室

（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；

（2）无菌室的消毒和防污染

每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；

每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；

每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。

（3）无菌室使用要求

① 无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；

② 无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以免减少紫外线穿透的影响；

③ 处理和接种标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

2. 超净工作台

超净台的使用与保养：

（1）风速稳定，且符合要求；

（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上；

（3）让超净台预工作10－15分钟；

（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

3. 无菌器材

（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；

（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

（3）无菌间一般只允许放置无菌操作台、转椅等物品；无菌操作台上一般只允许摆放以下物品： 酒精灯、打火机、接种针、消毒棉球、洗耳球、镊子、油性笔、灭菌平皿、试管架、灭菌吸管、电子天平、250ml灭菌三角瓶、培养基、均质器等。

无菌操作的基本技术

1. 无菌接种操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作，在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

2. 微生物检验过程中的无菌操作要求

（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

（5）在接种培养物时，协作应轻、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。