利用植物单宁处理天然橡胶胶乳以减少或抑制其过敏作用

植鞣剂是在许多植物及其衍生产品中发现的一大类天然多酚。其多功能分子允许它们在许多工业上应用，如皮革鞣制，钻井润滑，水处理中絮凝和粒子沉降，木材粘合。迄今为止最突出的单宁工业应用是在皮革生产上，这些源于各种植物的天然提取物已经应用了许多世纪。

如图1所示，缩合型单宁中的黄酮类分子因为它们拥有大量的羟基而极具特色，通过氢键作用是其工业用途的化学基础，特别是动物生皮胶原蛋白的鞣制，图2对此作了说明。

图1、单宁分子结构

众所周知，蛋白质是天然胶乳(NRL)技术中两大问题的中心，即乳胶制品引起的过敏，如手套和避孕套，以及乳胶生物降解的脆弱性。虽然这两个问题所带来的困惑已经被研究了数十年，但仍有待找到完整的解决办法。尽管植物单宁对蛋白质分子有众所周知的影响，但在皮革生产中长期鞣制的基础上，用单宁溶液处理LIN的方法尚未在专业文献上有过记载，也许它曾经有被尝试过。

图2、单宁(图上部)与胶原蛋白(图下部)之间的交互作用模型

如图2中的相互作用机制所建议的，在将动物生皮加工成皮革时，羟基会与胶原蛋白分子相连，经这种方法处理后，它们不再易受微生物攻击。此外，这些被改变的分子失去了它们作为蛋白质反应的能力，因为它们是以非常稳定和不可逆转的方式与单宁强氢键结合在一起的，这已经由皮革的稳定性所证实。如果它们被阻止细菌攻击，预计这将导致在高度特异的相互作用中，蛋白-单宁复合物无法发生诸如变应性致敏等反应。

整个这项工作花了4年时间，包括执行各种实验计划与测量和遵循的几个变量；全部工作的结果是发表了一篇博士论文，且一项关于这个问题的专利获得核准许可。

研究方法

材料

研究项目主要用料包括：天然乳胶（LIN），它是在巴西橡胶树人工林中无性系RRIM 600橡胶树收集的，作为正常的现场采割乳胶约含30%的干物质（应记录下来的是，在生产季节开始时，结合收集日观察到的异常高温，乳胶在采割期异常不稳定。这种情况会强烈影响样品的稳定性，下文有具体说明）；单宁，配制成25% (w/w)的水溶液，它是来自前一天从Tanac出售的粉末状威布尔植物单宁，该单宁是从黑相思树皮(黑荆树)中提取；两种认可的表面活性剂，包括来自Garden公司的阴离子型月桂基乙醚硫酸钠(SLES)商用水溶液，该溶液具有23%活性成份(w/w)和来自Oxiteno公司的非离子型表面活性剂Renex商业水溶液，它是一种壬基酚乙氧基化物溶液，其活性含量为27% (w/w)；硼砂作为一种温和的杀菌剂，被配制成5% (w/w)的水溶液来使用；氢氧化钾水溶液含量为2摩尔/升；氨（氢氧化铵水溶液）浓度为28%(w/w)。

天然胶乳样品配方 (NRL)

准备的乳胶配方如表1所示。

表1、处理和配方

分析与测量

乳胶随时间推移的物理和生物稳定性在测量和分析之前，观察了样品对乳胶一般方面的评价。随后的测定是在样品刚准备好之后和经过不同的时间以后进行的：

★ 气味嗅觉评分安排至少二名经验老到的评判员对样品评分。记分量表设置为从零到十：零意味着样品气味腐烂恶臭，十意味着样品有最新鲜的和令人愉快的乳胶香味。在五分这一中间点，样品气味开始从芳香变为不舒服。

★ pH值的测量是以通常的方式进行的，为准确测量，使用了专为更粘性介质设计的电极。

★ Zeta电位使用来自Malvern仪器公司的Zetasizer Nano Z90纳米粒径电位分析仪来测定，样品在水中稀释10000倍，以632.8 nm的激光测量。

蛋白致敏度

两份样品(12毫升)仍然以液体形式在Hermle Z 32 HKC设备中以8000rpm转速，16℃下离心60分钟。乳清和底层成分用一个长针注射器抽出，当中的胶乳重新用加氨水的水稀释（对照组样品），和加单宁的水稀释（单宁处理的配方样品），以这样的方式大致再现初始的条件。从这些样品中获得的乳胶薄膜经真空烘箱在60℃下24小时制备（三个阶段的样品，包括无离心和经一次和两次离心过滤）。从这些薄膜获得约3克的样本，被送往英国敦阿都拉萨研究中心，依照乳胶酶联免疫吸附试验(ELISA)，以测定特异过敏蛋白Hev b5和Hev b13的浓度。

结果与讨论

解释NRL 中单宁作用的理论模型建议

在展示实验结果之前，提出了胶体粒子防护屏蔽的理论模型来解释NRL的单宁活性。一个可能的理论建构可以建议在其中单宁与蛋白质周围的粒子配合，创造一种防护屏蔽，如图3所示。这种保护避免了通过空间位阻而不是离子排斥作用引起的胶体凝固，这通常与胶体稳定性有关。由于单宁分子有大量的羟基，它们的一部分被用于蛋白质的H键，但其它部分，在另一边可获得持水分子，使防护屏蔽更强。

乳胶保存时间的测量

样品在17天期间被观察了8次。初步实验结果表明，这一时期被认为是足可以验证单宁样品是否成功地保护NRL 抵抗腐变。最后是为处理HA（含高氨的对照样）和TBR（用单宁、杀菌剂、非离子型表面活性剂处理的样品）对挥发性脂肪酸(VHF)进行分析。

从一般特征的观察可以看出，对照样品颜色呈白色，无沾污，既不形成层也不形成沉积物。然而，表面出现小斑点，这些样品由于短时间内凝固而完全破坏，这个凝固时间取决于氨的百分比：低氨两天，高氨约16天。含单宁的样品呈淡粉红色，在整个17天观察期内没有凝固。当单宁处理乳胶老化时出现表面上的一些小斑点或污渍。单宁乳胶在样品容器的底部形成红色沉积物，标志着单宁红色的特征。当样品的剩余量被观察到时，有可能看到单宁配方样品仍然是液态的，在4个月的时间内没有凝固的迹象，而没有单宁的对照组都凝结了。这一观察证实了以前未发表的实验。这里应该做出解释的是，一些含氨NRL相当不寻常的短周期，而通常的可坚持几个月，这是由于在乳胶收集和实验设置的日子是橡胶生产季节的初期，这是NRL非常不稳定的时期，这与大约38~40℃的高温相吻合。

气味测试

表2显示了样品的气味记录。虽然实验受到不寻常的乳胶不稳定性的临界条件的影响，正如刚才所解释的，结果清楚地表明了不同处理之间的差异。样本LA（含低氨的对照样）的寿命非常短暂，在读数检验的第三天凝结。样品LAB（含低氨和杀菌剂的对照样）和样品HA有很强的氨蒸汽，妨碍了气味测试。然而，尽管它们的氨浓度较高，两个在408小时(17天)读数检验前已凝结。通常，低氨的NRL配方长时间不会自发凝固。如前所述，这些氨处理的不寻常的短暂寿命是由于乳胶本身的恶劣条件。然而，由于这种情况影响所有处理和在相同的严峻情况下进行所有处理的实验，结果突出了单宁样品的良好性能。

表2、气味测试结果

气味测试自然是主观的，但它提供了一个清晰而直接的结果，当采纳一组不同读数的结果时，可以是一个简单而有力的分析工具，就像在本例中所发生的那样。从表中可以很容易地观察到，在处理保存不良的乳胶与其它保存良好的乳胶（如那些用单宁处理的）有着明显不同的结果。对两种不同的单宁处理方法比较，可以区分这两个表面活性剂：离子型TBL样品（用单宁、杀菌剂、离子型表面活性剂处理的样品），以良好的条件开始，但会随时间推移不断降低其气味记分；而非离子型TBR样品直到本测试程序结束仍保持良好的气味。然而，即使在几个月后，两个样本在实验室的工作台上仍然是液体状。

表3、英国TARRC提供的过敏原蛋白、Hev b5和Hev b13

乳胶变质的气味表明了由于细菌的侵袭造成挥发性脂肪酸 (VFA) 的释放。如果单宁阻碍了蛋白质以防细菌腐变，为什么会产生VFA？原因很简单：单宁不是络合胶乳其它有机物质，如脂类、碳水化合物等富含有机培养基的成分，它们都容易受到细菌的降解。这就是在配方中存在轻度杀菌剂的原因。

图3、基于空间位阻单宁对乳胶胶体稳定性影响的屏蔽模型的示意图

pH值的测量

随着时间的推移，pH值的测量结果表示在图4中。如前所述，LIN是非常不稳定的，从LA样品可以看到，即使含氨也非常不稳定，表现在其高的初始pH值(9.44)和第3次读数检验(54小时)时已凝固。处理LAB和HA，其它两个无单宁对照样品，在第17天读数检验前凝结。尽管实验开始时的pH值低于8.78，但LAB样品保持液态时间长于LA样品，与HA时间相同。这种行为可以归因于杀菌剂的存在。

图4、pH结果：LA(低氨)，LBA(低氨和杀菌剂)，HA(高氨)，TBL(单宁，杀菌剂和离子表面活性剂) 和TBR(单宁，杀菌剂和非离子型表面活性剂)

值得注意的是，所有的对照样本经历凝固和完全破坏过程，并呈现出连续的pH值下降，而两种经单宁处理的在较低的酸碱度下仍然是液体（未处理常规乳胶应该是凝聚的）。对于两种单宁样品，在开始阶段有明显的pH值下降，接着是稳定期，这可能意味着单宁在保护着蛋白质;但也有其它可消化的化合物，如不被多酚所络合的糖和磷脂，这支持了单宁造成的差异使胶体更稳定的观点。通过对pH值客观测量的观察，加强了胶体粒子保护屏蔽模型，其作用机理是通过空间位阻而不是离子胶体保护来实现，尽管显然有必要做额外的工作，并提供更多的细节来支持该模型。

zeta电位随时间变化的研究进展

如图5所示，所有的zeta电位测量都是负的，范围从-32到-29 mV，在胶体中，橡胶微粒被负电荷的蛋白质和磷脂所包围。随着时间的推移，zeta电位在头100小时内通过最小值，然后在200小时后开始增加以达到稳定的数值。第一个观察可以指向样品LA: 它开始以高胶体保护，-36.4 mV，在30小时以后这个值减少到-29 mV，然后凝固。样品LBA和HA在zeta电位大约分别为-25 mV和-29 mV时凝固。因此，-25 mV到-30 mV的区域是关键的，可以作为发生在正在研究的系统凝固之前的一个可能的极限范围，何时和是否保护主要是基于单离子保护。在图的第二部分，样品TBR显示zeta电位在-26 mV和-24 mV之间。这整个区间是低于-29 mV的限制，处于上述限制范围内，这意味着TBR本应自身凝固，因为只有静电粒子稳定将无法保持胶体稳定。然而，在17天的观察中，样品TBR停留在液体状态，显示出最佳的气味评分。这种乳胶不寻常的行为也支持另一种胶体保护，肯定了建议的屏蔽模型。

图5、样品的zeta电位(mV)与时间关系图

蛋白质过敏的量化

表3显示了由英国赫特福德敦阿都拉萨研究中心(TARRC)确定的结果，依据ELISA对两种研究得最多的乳胶过敏蛋白hev b5和hev b13进行测试。通过做这些测定，注意力是驱使去寻找氨样品、HA和含单宁的样品、TBR之间的差异，这在实验的第一部分提供了最好的一组结果。在Hev b5结果中，5个单宁样品中的3个结果低于检测方法(TBL/NC，TBR/NC and TBL/CI)的限度，这里没有观察氨样品，可见增加了更多的迹象，即单宁可能起作用而减少了致敏性。

然而，对Hev b13的测量并不能提供如此直接的可视性。在无离心的情况下，TBR样品的结果两倍于氨样品的结果;但这种模式在两个离心阶段发生了逆转，在最后一次变得更低，随着两次离心过滤，其中氨样品呈现出浓度为每克干乳胶膜含50 µg的Hev b13，几乎三倍于单宁样品17 µg的结果。只要考虑到Hev b13是存在于乳胶胶体中，就可以理解这些非常清楚的结果和它们的位置交换。正如在专业文献中所发表的那样，这种蛋白质的一部分位于胶乳黄体颗粒内，在那里，单宁不可能达到这些分子中。然而，在离心过程中，作为较重的粒子，大部分的黄体被淘汰，但可能其中一小部分在离心机的强剪切力下被破坏而释放出过敏蛋白到乳清中，然后在那里它们可以与单宁复合，导致ELISA观察的结果。这一事实也可以理解为对屏蔽模型建议的支持，认可多酚类单宁正在络合蛋白（通常包括过敏蛋白）。虽然有大量的空间为其它必要的实验来证实这种单宁作用可减少甚至消除乳胶过敏，但TARRC分析提供的结果为处理这一重要课题开辟了新的研究途径。

单宁蛋白颗粒屏蔽模型的探讨

值得一提的是，长时间的实验得出的结果并非是所有都在这里一一介绍，因为它们是作为作者的博士论文(葡萄牙语)发表的。但是，为了合理起见，下面的文案中提及了所有的主要实验结论。

作为实验结果而产生的客观数据，将用于支持这种观点，即单宁在NRL的两项建议（乳胶生物保护和减少过敏）中提供结构上的积极变化，详见如下：

1、在单宁、温和杀菌剂、离子或非离子表面活性剂以及氢氧化钾等处理基础上稳定了一种极其不稳定的巴西橡胶树胶乳。

2、尽管含氨的对照样品持续时间不到17天，但单宁样品在实验室的试验台上观察了超过5个月显示是稳定的，并保持了其流体特性。

3、对于因乳胶降解而产生的挥发性脂肪酸释放，单宁处理样品比对照样品低得多。

4、因此，经过几个月的老化，单宁处理样品的气味是合理的，而含氨对照样品则呈现出强烈的气味，表现了有机物质的细菌降解特征。

5、单宁样品的pH值是在NR胶乳应正常凝固的一个区隔内，但并没有被观察到。

6、单宁样品的zeta电位测量下降到它们应该凝结的一个范围内，但它们是液体。

7、用非离子型表面活性剂处理的单宁通常比离子型具有更好的稳定性。

8、含非离子表面活性剂的单宁样品比其离子型对照样具有更高的动态粘度。

9、通过流体力学颗粒直径测量，观察到相似行为；非离子型表面活性剂处理的单宁样品比离子型表面活性剂处理的单宁样品的值高。

这一整套基于实验室结果的客观事实，可用于支持建议的模型，其中单宁分子与NRL橡胶微粒周围的蛋白质络合，建立一种屏蔽，基于空间位阻，阻碍粒子相互凝聚。相比通常观察到的粒子通过离子力保护作用，这种情况将保持胶体系统流体和良好的状态。水分子所吸引的在粒子相反一面的单宁羟基将带来更强的屏蔽防护。

根据建议和观察，这种屏蔽模型表明，在不使用传统的防腐剂氨抗聚结的情况下，生乳胶是稳定的。因此，在微粒附近建立的同样屏蔽将阻碍它们互相合并，并且避免与乳胶腐败相关的细菌攻击橡胶微粒附近的蛋白质。

此外，如果这个模型可以解释得到的结果，可以预期，与单宁分子相连的蛋白质，作为屏蔽本身的一部分，将不会作为过敏原。由于在巴西利亚大学化学研究所的实验性限制，这一结果，即NRL保护阻止无氨衰变和聚结，还没有从实验中得到完全证明。采用具体的实验程序，包括适当的方法和试点生产进行实际测试，单宁处理处致的致敏性下降的全貌将得到更好的支持。然而，在这个ELISA实验可能得到的迹象，通过围绕粒子和建立屏蔽，或通常通过稳定乳清，完全符合单宁可真正防止蛋白质发生正常蛋白质反应（包括过敏反应）的理由。

结论

本文研究了利用植物单宁生产致敏作用减弱的低蛋白乳胶。同时，单宁通过与蛋白质络合提供了另一种途径，以保护乳胶抵抗细菌腐变和阻止无氨物理聚结。虽然这项建议在技术和科学背景上是合理的，但在科技文献中没有发现这种试验报道。

本研究的主要结论是引入单宁作为橡胶树乳胶化学研究的一个新的潜在组成部分的重要性。为了成为一个具有持续贡献的主角，它依赖于进一步的研究，以确定反应物混合的顺序，通用处理系统以及其它相关方面。然而，在实验室工作台规模和现场现实之间还有许多步骤需要更多的研究工作来寻找合适的配方和工艺参数。

关于使用单宁处理NR胶乳抗腐变功效的初步问题的答案是肯定的。没有昂贵的添加剂和只通过简单的加工的无氨乳液的可能性，已经是一个有趣的发现。如果，再加上可以通过非常简单的技术处理来摆脱乳胶过敏原的可能性这一点，然后将这项研究转化到乳胶工业中，必将是一个重大的贡献。