皮肤护理新方法——重置皮肤细胞生物钟

摘要

本文介绍了皮肤细胞新陈代谢的昼夜节律同步机制。提供了护肤的新方法，即皮肤同步机制。

关键词  昼夜节律，生物钟基因，时间重置，“太阳光模拟”

大量的生理过程（例如心跳和血流，体温，肾脏活动，肝脏代谢等）受昼夜节律周期的调节，昼夜节律周期是白天和晚上的定期连续的活动。事实上，生物体与“环境动荡”的同步调节对健康乃至生存至关重要。相比于人体其他器官，皮肤更需要对其生物节律的严格控制，因为皮肤直接暴露在高光量下。与此一致，皮肤的许多重要功能如汗腺分泌汗液，表皮细胞增殖，皮脂排泄和屏障功能等会在24小时内波动。作为一般性考虑，在白天，皮肤会合理地促进其保护功能（挑战性阶段），这有利于夜间皮肤再生（恢复阶段）。许多报道已经描述了皮肤的昼夜节律如何调控局部治疗的功效及其副作用。

现已在皮肤的“时间规划”的分子机制理解方面取得了最新进展，从而为美容治疗开辟了新的视野。一些对皮肤变量时间组织的改善对皮肤护理来说是一个新的有吸引力的问题。

驱动生物节律的机制

两个单独的机制参与同步生物节律的设置和维持。

当然，阳光是主要的“同步”信号。视网膜中光感受器的激活及通过视网膜下丘脑束传递至中枢神经系统，触发神经输出和产生内分泌物，其将使周围器官同步。

独立于另一种机制，第二种机制是一种内在的计时机制，通常称为“生物钟”或“生物节律”。这是一个细胞自主过程，涉及几个参与自动调节环路的细胞内蛋白质。80多种基因表达与生物节律有关，其中一些被称为“生物钟基因”，主要参与细胞生物钟运转的调节。这些基因似乎调节了大部分细胞分子的运转。第二个内部机制可能有助于自适应系统“预测”环境剧变，但其中一个结果是需要不断重新设置内部时钟。例如内生的细胞振荡器必须遵循环境波动如季节变化等。这两种机制的同步性中断在夏令，时差或晚年时期都会遇到。

皮肤在同步性维持的特异性

外围组织，包括皮肤组织，具有细胞内振荡器，因此皮肤具有自己的内部生物钟。角质形成细胞和成纤维细胞表达一些“生物钟基因”。因此，从理论上来讲，皮肤可能会遭遇同步性破坏，对生物节律的功能产生消极影响，同步化是皮肤特别关注的问题。事实上，在新生儿中，节律性首先出现在皮肤组织中。似乎基于这个原因，皮肤具有与视网膜驱动的重置机制类似的特定的“重置机制”。

体内和体外实验表明，皮肤表现为“视网膜外光感受器”，也就是说，光可以直接（独立于视觉路径）促使皮肤细胞的昼夜节律内部时钟产生。一些盲人患者维持血浆中褪黑激素浓度的昼夜节律，并且表明受限于身体部位（没有光到达视网膜）的光照可以改变一些昼夜节律的生物过程。在面部皮肤和身体皮肤中（不暴露于阳光下），也会使生物节律发生轻微改变，这种改变也表明光线对皮肤的直接影响。最近研究显示，紫外线B（UVB）可以诱导角质形成细胞中生物钟基因的节律性表达。

据作者说，UVB重置皮肤昼夜节律的能力依赖于信号转导的氧化还原调节。这组数据表明，由于特定的“重置机制”激活不足，皮肤组织可能遭遇有限的“同步性破坏”（视网膜驱动机制仍是主要的“起搏器”）。

这些研究结果促使我们调查了化学“阳光模拟”（GAEI）的影响，能够重现低剂量UVB辐射（氧化还原调节）对表皮细胞生物钟的影响。为此，我们设计了一种新颖的实验模型。

体外研究表皮的节律过程

人类重建表皮（HRE）是从正常角质形成细胞获得的3-D体外模型，与正常表皮呈现出高组织形态学和生物化学同源性。人类重建表皮暴露于低剂量的太阳模拟辐射（SSR：波长在250和800nm之间），或与“阳光模拟”化合物GAEI孵育（图1）。

图1. 监测表皮生物节律过程的实验设计

对暴露于刺激（太阳模拟辐射或阳光模拟化合物GAEI）后几个终点的监测：

1. 评估细胞活力和基因毒性

对人体重建表皮（HRE）节律过程的可靠监测需要表明两种刺激都不会引起细胞毒性或遗传毒性。用两种方法（MTT和LDH释放实验）重复检查核对细胞活力。辐射导致的细胞死亡非常有限，因此其不会干扰昼夜节律过程。如表1所示为太阳模拟辐射后细胞活力变化的代表性例子。

表1. hRE 暴露于SSR（2 kJ•m-2），运用MTT 和LDh 释放实验重复检查细胞活力（n.D.：未检测到）

当HRE孵育在“阳光模拟“GAEI中，细胞活力无显著变化（未显示数据）。这种活性成分的无毒性已经在类似的实验条件下得到验证。

预测了SSR不会造成主要DNA损伤。苏木精-伊红染色后的组织学研究证实：HRE暴露于SSR或GAEI后没有出现凋亡细胞（具有固缩的细胞核和强嗜酸性细胞质的细胞）。

图2. 在人体重建表皮中昼夜节律时钟基因的表达。检测的PCR 产物。泳道1 是DNA 标准分子量梯；泳道2 位β-actin （538pb）；泳道3 是clock 基因（488pb）；泳道4 是per-1 基因（382pb）

此外，使用半定量逆转录和聚合酶链式反应技术（RT-PCR）监测在皮肤细胞中组成性表达的参考“昼夜节律”β-肌动蛋白基因（“管家基因”）的表达水平。外部刺激，SSR或GAEI不能诱导“管家基因”表达水平的显着变化。这说明了对基因组表达水平的有限影响。

2. 生物钟基因表达的评估

两个生物钟基因per-1和clock的表达水平通过半定量RT-PCR测定，per-1和clock编码内部时钟设置转录因子PER和CLOCK。在3-D体外模型中，per-1和clock基因的表达扩增后通过电泳检测（如图2所示），在定量per-1和clock表达水平时外界环境保持稳定无任何刺激。之前已经报道过2-D人类角质形成细胞中per-1和clock的表达量。

3. 生物功能振荡的评估

免疫组织化学检测人体重建表皮中KI67的表达来评估表皮细胞增殖。平行进行转录活性（总RNA合成）和翻译活性（总蛋白质合成）的互补测量。

此外，还研究了维生素D的代谢。一项初步实验采用B.Lehmann及其同事所描述的HPLC方法来评估维生素前体7-脱氢胆固醇（7-DHC）向维生素D3前体（pre-VD3）的光转化。在我们的实验中发现用太阳光模拟辐射（SSR）后在表皮内会产生限量但仍可测量的VD3前体物质pre-VD3（图3所示）。

图3. 人体重建表皮HRE暴露于太阳光模拟辐射（SSR）（2kJ•m-2）后，HPLC 监测7- 脱氢胆固醇（7-DHC）转化为维生素D3 前体（pre-VD3）情况。然后，通过半定量RT-PCR 确定编码25OHD-1α 羟化酶（1OHase）基因的表达水平，25OHD-1α 羟化酶（1OHase）是将VD3 前体pre-VD3 转化为表皮分化二羟维生素D（骨化三醇）的重要调节因子

实验结果

1. 太阳光模拟辐射（SSR）诱导生物钟基因的振荡

用SSR（2kJ•m-2）照射后，在35小时内监测昼夜节律时钟基因per-1和clock的表达水平。为了使测量更加可靠，时钟基因的表达水平与通过对应时间点的β-actin（β-肌动蛋白）相对值表示。

图4. 使用半定量RT-PCR 测定生物钟基因的相对表达水平

（昼夜节律基因/β-肌动蛋白）阳光辐射过的/（昼夜节律基因/β-肌动蛋白）阳光未辐射的昼夜节律基因相对表达水平在辐射约14小时SSR后达到峰值，并且在约24小时后回落至基线值。per-1的变化比clock基因更加显著。有趣的是，辐照35小时后per-1和clock的相对表达量表明SSR能够诱导per-1和clock的节律性表达。基础表达水平和变化幅度可能在不同实验中存在很大差异，但一般来说其变化周期约为24小时。

图5. 谷氨酰胺基乙基咪唑（GAEI）的化学结构式

2. “阳光模拟”GAEI对时钟基因的影响

谷氨酰胺基乙基咪唑（GAEI）是为改善皮肤渗透和抵御酶失活而设计的拟肽（图5）。在表皮中少量添加（剂量在微摩尔范围内），GAEI能够产生无毒性低量的具有氧化还原活性的超氧阴离子假设来自活性氧（ROS）的微量活性种是通过日光调节昼夜节律基因表达的效应物10。由于GAEI在较高浓度下（毫摩尔范围内）不能诱导ROS的过量产生，它具有抗氧化剂活性。

图6. HRE 暴露于SSR（2kJ•m-2）或GAEI（50mM）后通过半定量RT-PCR 检测per-1 基因相对表达水平

“阳光模拟”GAEI是以CHRONOCYCLIN（注册商标）为商品名的专利产品。

图7. HRE 暴露于SSR（2kJ•m-2）或GAEI（50mM）后通过半定量RT-PCR 检测clock 基因的相对表达水平

人体重建表皮与50mM的GAEI在无光照条件下孵育，并记录clock和per-1生物钟基因的表达谱。动力学曲线与用SSR照射后的非常相似（图6和7所示）。

3. 暴露于刺激后的生物振荡

由per-1和clock编码的蛋白质PER和CLOCK的作用仍不清楚。然而，它们的核定位及其在某些细胞周期的特定阶段的表达表明它们参与细胞增殖调控。

尝试将时钟基因的RT-PCR数据与转录（量化从HRE提取总RNA）或翻译（总蛋白的量化）的活性关联起来却是不成功的。

HRE中KI67蛋白的免疫染色给出了一些结论，然而，免疫染色技术缺乏重现性从而妨碍了有效的相关性。如图8所示。

图8. 用阳光模拟GAEI 处理的HRE 中KI67 蛋白质表达时程

昼夜节律生物钟基因变异与另一种“光驱动”生化过程维生素D代谢具有相关性。将HRE暴露于SSR或“阳光模拟”GAEI之后，1OHase编码基因（1OHase编码催化维生素D中间体生物转化成骨化三醇的酶）的表达将具有节律性并大致遵循clock和per-1的动力学变化（图9所示）。

图9. 暴露于SSR 或用“阳光模拟”GAEI 处理后编码25OHD-1α羟化酶的基因（1OHase）的表达水平

结论

我们已经证实，无毒低剂量的太阳辐射因子能调控表皮细胞中生物钟基因的表达。研究结果说明：表皮细胞内部时钟“直接重置机制”可能涉及昼夜条件的代谢调节。本次实验揭示，“阳光模拟”GAEI是一种能够技能重现低剂量UVB辐射（氧化还原调节），也可以与模拟太阳辐射的类似方式“重置”生物钟基因的一种化合物。本文证明了生物钟基因重置可能会优化皮肤的屏障功能。表皮中维生素D的代谢，似乎受生物钟基因的调控。维生素D主要维持皮肤渗透屏障的稳态。

现代生活方式可能是导致生物钟与“环境时间”同步性破坏的主要原因，时差是导致生理学不适的常见后果，但是夜间工作和睡眠不足也会导致去同步性相关的病态。长期的同步性破坏与衰老相关。同步性破坏也可能发生在皮肤上，并且“内部振荡”和“环境振荡”的严格一致性对于皮肤是必须的，这会带来一些严重后果，如屏障功能减弱，脱水，防御系统受损，因此，“阳光模拟”GAEI可产生一个“唤醒信号”，从而帮助皮肤更好地适应昼夜节律变化。