一种新型机械加压方案对人体面部皮肤细胞分子应答的影响

引言

皮肤是人体最大的器官，构成了人体与环境之间的物理屏障，可以保护人体免受紫外线辐射和毒素侵害。

老化皮肤的特征是真皮与表皮连接处变平、萎缩程度加重及真皮结缔组织丧失弹性。

本研究测试了这样一种假设：在由人体真皮成纤维细胞构成的人类皮肤类似物（3D胶原蛋白凝胶）上应用一种独特的动态机械加压方案（刺激变化），会导致与健康皮肤相关，以及有可能与皮肤修复相关的有益分子生成（正向调节）。

材料与方法

从美国模式培养物集存库（ATCC）获得来自两个不同供体（女性，高加索人，年龄50到56岁，非吸烟者）的人体真皮成纤维细胞（HDF），让其在37℃和5%浓度CO2的条件下，在加入7.5%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）中生长。供体A和供体B捐献的细胞分别来自于脸颊和太阳穴。

图1. 供体A（A）和供体B（B）细胞在胶原蛋白凝胶内隔离7 天后的共聚焦图像。图像表明凝胶内的绝大多数细胞（绿色荧光）在7 天后仍可存活

将HDF接种于胶原蛋白凝胶（4mg/ml）中。可行性研究表明，7天后细胞仍然能够在凝胶内存活（图1）。固化后，将接种了细胞的胶原蛋白凝胶以无菌方式装入无菌的Electroforce 5200 Biodynamic™培养室内（参见图2A-C）1。胶原蛋白凝胶由样品架压盘固定就位2，以35ml/分钟的流速向培养室供应培养基。

以15Hz的频率对胶原蛋白凝胶加压处理2分钟（25％压力）。处理过后，静置凝胶16小时，再次重复2分钟处理周期，而后在0mm静置1小时（急性处理）。急性方案只有一个16小时的周期，而慢性处理包括最初处理2分钟、静置16小时、处理2分钟、静置8小时，重复进行共4天。

对照培养室装有接种了细胞并且不经受任何机械加压的胶原蛋白凝胶，凝胶的营养供应按照测试凝胶进行。

图2. （A）测试压盘示意图和特写照片，（B）Electroforce 5200 Biodynamic测试系统，（C）Biodynamic测试培养室、样品和样品压盘

完成实验后，将测试和对照胶原蛋白凝胶置于RNAlater™中，4℃下保存。按照制造商提供的说明，用mirVana™ RNA提取试剂盒（美国赛默飞世尔Invitrogen）提取RNA。

使用Omniscript试剂盒（美国Qiagen）进行逆转录。所得cDNA用Bio-Rad（美国）iCycler和人类特异性引物组进行扩增，用于分子评估。所得值针对18S基因（管家基因）进行归一化。将实验值除以对照值，得出倍数变化。

结果

观察到急性处理（16小时）方案对两个供体细胞群中双糖链蛋白聚糖、I型胶原蛋白、TGF-β、MMP-1、MMP-2、TIMP-1和TIMP-3的mRNA水平均产生了显著的正向调节（图3）。

观察到慢性处理（4天）方案延续了急性处理后在两个供体细胞群中发现的趋势。也存在一些例外情况：供体A细胞群观察到MMP-2显著减少，而供体A的双糖链蛋白聚糖及供体B的MMP-1和MMP-2显著增加（图3）。

讨论

施加在接种了细胞的胶原蛋白凝胶上的机械加压方案（在初步研究中进行了优化）对与水合作用、结构重塑及再生有关的有益分子产生了显著的正向调节。急性和慢性处理方案均观察了到此类反应。

尽管对两个供体细胞群体均有显著的正向调节，但供体A和B之间在应答强度上存在着差异。这些数据表明供体A是快速应答者，而且可能是高水平应答者；供体B则是较慢、较低水平的应答者。造成这些差异的原因可能是两个供体之间在遗传学或表观遗传学方面的差异，也可能是环境暴露的差异，有待进一步研究。

参考文献

1. Armentano RL, Valdez Jasso D, Cymberknop LJ, Montini Ballarin F, Velez D, Caracciolo PC, Abraham G. High pressure assessment of bilayered electrospun vascular grafts by means of an Electroforce Biodynamic System®. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2015; 3533–3536

2. Lu J, Laudinet J, Williams S. Mechanical stimulation and evaluation of hydrogel biomaterial. Biomed Mater Eng. 2008; 18: 335–337