HPLC法测定蛋糕中丙酸钙含量的不确定度评定

丙酸钙作为防腐剂可以添加在焙烤类食品中，限量为2.5g/kg( 以丙酸计)。高效液相色谱法(HPLC) 是测定食品中丙酸钙的国家标准方法。测量不确定度是与测量结果相联系的参数，用于表征合理地赋予被测量之值的分散性。当测量结果处于临界值时食品检验机构必须进行测量不确定度评定。本文对HPLC法测定焙烤类食品( 蛋糕) 中丙酸钙含量的不确定度因素进行了评定，计算出不确定度并报告了结果。

1 仪器、试剂

1.1 仪器

1) 高效液相色谱仪，岛津LC-20A 附紫外检测器和自动进样器；2) 高速冷冻离心机，北京雷勃尔LR10-2.4A；3) 超声波清洗器，昆山市超声仪器KQ-100)；4) 高速组织捣碎机，上海精科DS-1；5)pH 计, 上海仪电科学PHS-3C；6) 电子天平，上海上天FA2004；7) 溶剂过滤器及0.45μm 微孔滤膜。

1.2 试剂： 分析纯磷酸(H3PO4)、分析纯磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4]

1.3 实验室用超纯水

1.4 食品添加剂丙酸钙纯度标准物质 GBW(E)100078

2 色谱分析条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914

流动相：1.5g/L 磷酸氢二铵溶液, 用1 mol/L 磷酸溶液调pH 为3.0( 使用时配制); 经0.45μm 微孔滤膜过滤；

流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；紫外检测器波长：214nm；

3 样品处理与测试

3.1 依据国家标准GB 5009.120-2016 进行试验

3.2 样品制备：蛋糕样品经组织捣碎机捣碎混匀后备用；

3.3 试样处理：准确称取由组织捣碎机混匀后的样品5g(精确至0.0001g) 试样至100mL 烧杯中, 加水20mL, 加入1mol/L磷酸溶液0.5mL, 混匀, 经超声浸提10min后, 用1mol/L磷酸溶液调pH为3 左右, 转移试样至50mL容量瓶中, 用水定容至刻度, 摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中, 以不低于4000r/min 离心10min, 取上清液, 经0.45μm微孔滤膜过滤后, 待液相色谱测定。

3.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

3.4.1 丙酸标准贮备液(10mg/mL)：精确称取0.3146g丙酸钙标准品于25mL 容量瓶中, 加水至刻度；

3.4.2 标准曲线的绘制：准确吸取5.0mL标准储备液于50mL容量瓶中, 用水稀释至刻度, 配制成浓度为1.0mg/mL 标准工作液。再准确吸取标准工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 至10mL容量瓶中, 分别加入1mol/L 磷酸0.2mL, 用水定容至10mL, 混匀。其丙酸标准溶液的最终浓度分别为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL, 经0.45μm 微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样分析，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

4 测量数学模型

样品中丙酸钙含量( 以丙酸计), 按式(1) 计算：


式中：X—样品中丙酸钙的含量( 以丙酸计), 单位为克每千克(g/kg)；c—由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度, 单位为毫克每毫升(mg/mL)；V—样液最后定容体积, 单位为毫升(mL)；m—样品质量, 单位为克(g)；f—稀释倍数。

试样中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2569, 即得丙酸钙含量。

计算结果保留三位有效数字。

5 根据数学模型分析，影响不确定度来源有以下几方面

①样品称量引起的不确定度, ②样品定容引入的不确定度, ③样品平行测定引起的不确定度, ④标准系列溶液引起的不确定度, ⑤标准拟合引入的不确定度。

6 不确定度评定

6.1 样品称量引起的不确定度(B 类不确定度)

本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg,由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2 次。则
称样量为5.0026g， 相对不确定度为：Urel(m1)=u(m1)/m=0.00043/5.0026=8.6×10-5；

6.2 样品平行测定引起的不确定度(A 类不确定度)

试验中对同一样品丙酸钙的含量进行了3 次平行测定其结果分别为：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg， 平均值X=1.08g/kg, 标准偏差


按均匀分布计算，其不确定度为kg，则相对不确定度为

6.3 样品定容体积引入的不确定度(B 类不确定度)

6.3.1 20℃时50mLA 级容量瓶的允许误差为±0.05mL, 按均匀分布计算，由此带来的不确定度为6.3.2 50mLA 级容量瓶重复充液2 次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C 及自由度υ, 则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.3.3 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4， 温差变化引起体积的变化为：50×2×2.1×10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：

则样品定容引入的相对不确定度：



6.4 标准系列溶液引入的不确定度(B 类不确定度)

6.4.1 标准储备液引入的不确定度

6.4.1.1 丙酸钙标准品的纯度，证书上给出的纯度99.7%，不确定度为0.6%，则标准物质引入的不确定度

6.4.1.2 本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg, 由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2 次。则, 称标准品为0.3146g，则由称量引入的相对不确定度为：0.00043/0.3146=0.0014；

6.4.1.3 标准物质稀释引入的不确定度

6.4.1.3.1 20 ℃ 时25mLA 级容量瓶的允许误差为±0.03mL, 按均匀分布计算，由此带来的不确定度为=0.0173mL；

6.4.1.3.2 25mLA 级容量瓶重复充液2 次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C 及自由度υ, 则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10-2mL；

6.4.1.3.3 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10-4，温差变化引起体积的变化为：25×2×2.1×10^-4=0.0105mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：

则标准储备液由稀释引入的相对不确定度：

由此，丙酸钙标准储备液引入的不确定度为：

6.4.2 标准系列溶液由稀释引入的不确定度

6.4.2.1 由5mL A 级单标移液管引起的相对不确定度来自三个分量

6.4.2.1.1 5mL A 级单标移液管引的容量误差查证书为±0.015mL，按均匀分布，不确定度为

6.4.2.1.2 5mL A 级单标移液管的充液重复性引起的不确定度，重复充液两次，用极差计算，其极差为R=0.015mL,由极差系数C 及自由度υ， 则由充液引入的不确定度为0.015/1.13=0.013mL(mL)；

6.4.2.1.3 试验温度变化为±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，按均匀分布，由温度变化引入的不确定度为2.1则5mLA 级单标移液管体积引入的不确定度为

由此，5mL A 级单标移液管体积引入的相对不确定度为0.016/5.00=0.0032

6.4.2.2 标液定容体积引入的不确定度

6.4.2.2.1 50mLA 级容量瓶体积引入的相对不确定度6.4.2.2.1.1 20 ℃ 时50mLA 级容量瓶的允许误差为±0.05mL, 按均匀分布计算，由此带来的不确定度为=0.0289mL；

6.4.2.2.1.2 50mLA 级容量瓶重复充液2 次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.4.2.2.1.3 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，温差变化引起体积的变化为：50×2×2.1×10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：

由此，50mLA 级容量瓶体积引入的相对不确定度为

6.4.2.2.2 10mLA 级容量瓶体积引入的相对不确定度

6.4.2.2.2.1 20 ℃ 时10mLA 级容量瓶的允许误差为±0.02mL, 按均匀分布计算，由此带来的不确定度为=0.0115mL；

6.4.2.2.2.2 10mLA 级容量瓶重复充液2 次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C 及自由度υ，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10^-2mL；

6.4.2.2.2.3 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，温差变化引起体积的变化为：10×2×2.1×10^-4=0.0042mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：

由此，10mLA 级容量瓶体积引入的相对不确定度为：

至此，标准系列溶液由稀释引入的不确定度：

6.4.3 标准曲线拟合引起的不确定度

采用7 个浓度水平丙酸钙标准溶液，得出峰面积，用最小二乘法拟合，得到标准曲线Y=175471x+2485.6，本试验对同一样品进行了3 次测量，求得平均值，因此由标准曲线拟合带来的标准不确定度为：

式中：SR 回归曲线的剩余标准差，b 为斜率，p 为待测样品的重复测定次数(p=3)，n 为回归曲线的点数n=7，待测样品浓度的平均值， 为回归曲线各点浓度的平均值， 为各标准溶液浓度值。其中，

式中：A0j 为各标准溶液的实际相应值，（a+bC0j）为根据回归曲线算出来的理论值，由上述表中数据计算出SR 回归曲线的剩余标准差，

即：

由标准物质及曲线拟合产生的不确定度为：

B 类不确定度为

合成不确定度：

扩展不确定度： 取p=95%,kp=2, 则U=u_c ×k=0.025×2=0.05g/kg

报告结果：1.08±0.05g/kg(k=2)

不确定度表达测量结果的分散程度，是一个定量的概念，可以用定量的数字描述。本文对HPLC法测定焙烤类食品( 蛋糕)中丙酸钙含量的不确定度因素进行了评定，若检测结果处于标准限量的临界值或标准方法有要求时，必须结合不确定对检测结果进行评判。