深入了解MALDI质谱技术在新药研发中的应用

简介

本文通过介绍药物超高通量筛选（uHTS）和药物组织分布MALDI成像两项检测方案，探讨了近年来MALDI（基质辅助激光解吸电离）质谱技术在加速临床前新药研发方面的创新性应用。

越早失败，代价越低——这是医药研发领域流传的一句老生常谈，多年来科学家们一直将其奉为信条。各行各业的实践证实这一原则可以推动创新。制药行业通常采用的做法，是利用技术和自动化来快速筛查化合物数据库以寻找“目标”，并在研发过程尽早融合吸收、分配、代谢、排泄以及毒性（ADME/TOX）等方面的研究，从而了解药物分布和代谢的重要细节。这种做法无疑为近年来生产率的提升做出了贡献。2015年至2016年间新药研究同比增长估计为11.5%，其中增长幅度最高的是临床前阶段。据报道，处于这一阶段的化合物从2015年的6061种增长到2016年的6861种。（1）

基本情况

关于小分子药物研发理想的分析工具所具备的特点，业界已有颇多论述，比如非标记定量技术，无需探针并能够对目标分析物进行直接检测与定量分析。另外，快速、稳健、易用、成本效益高并可实现自动化等特性也备受关注。

质谱（MS）技术在本质上满足了上述诸多标准，并在过去几年为MALDI MS开启了新的舞台。MALDI可与各种不同的质量分析器联用，最常见的是轴向TOF（飞行时间）质量检测器。根据分析需要也会使用MALDI与正交TOF或FT ICR（傅里叶变换离子回旋共振）等其它质量分析器组成的质谱仪。

目前，MALDI MS技术已在一系列新药发现与开发中得到应用，帮助研究人员识别出最具前景的小分子药物，并向“大”制药公司所依赖的超高通量化合物筛选项目扩展。同样，MALDI质谱成像（MSI）技术能够帮助开发人员在进行定量全身放射自显影法（QWBA）实验前，了解候选化合物及其相关代谢物在组织中的空间分布和组织生理情况。从而，在决定是否对候选化合物进行下一阶段研发时，帮助新药研发人员做出明智的决定。

同样值得注意的是，许多候选化合物会产生具有生物活性的代谢产物。这些活性代谢物可能具有与其原型药物不同的药理作用和药物动力学特性。全面了解活性代谢物的特性是毒性评估的核心，也是否决某种候选化合物的头号原因。掌握药物代谢酶的早期信息，对设计药物间相互作用的研究非常有价值。

MALDI质谱成像实验流程

做MALDI成像实验时，首先要将组织切片固定在MALDI靶板上，并在整个组织表面添加覆盖基质，然后进行激光扫描。激光在虚拟网格的每个离散位置上轰击扫描组织切片，获得质谱图。通过绘制组织上离子强度的X 和Y 坐标函数图像，实现分析物离子成像。

弹出提示：MALDI 质谱成像（MALDI MSI）基本原理

此外，MALDI也应用于生物制药的质量控制，以及基础研究和临床诊断，例如自动化的微生物鉴定。这些应用不在本文涉及的范围之内。

先进的新技术、新工具

随着MALDI成为新药研发领域功能强大的技术，仪器制造商们将注意力转向了MALDI质谱仪关键组件的改进。由于企业用户寻求改善绩效、降低成本和简化研究人员工作流程，因此系统组件的改进已经成为仪器制造商们深度开发的项目。针对不同的应用项目，企业用户的具体要求可能会不同，比如高通量筛选检测方案关注的是速度、通量和每个样本的测定成本等因素，而MALDI组织成像检测方案注重的是成像的分辨率和检测灵敏度。然而，为了满足专项应用方案的需求，而对关键组件进行的改进和优化，都会全面提升MALDI质谱仪的性能和检测方案的效率。

MALDI质谱系统的核心是以频率10kHz运行的一种高速激光器。稳定性对于空间和质量分辨率而言都至关重要，因此，改善透镜、反射器和检测器等光学系统的精密度，能够大幅度提高仪器的性能。图1 为典型的TOF / TOF离子光学路径。

重要的是，扩展MALDI质谱系统的性能范围需要高速激光器。当今的尖端系统意味着需要用10 kHz的激光器，但采用10 kHz 激光器需要先解决许多技术和机械问题。例如，传统的MALDI-TOF质谱仪的设计是激光点固定不动，样品靶板根据激光点的位置进行移动并定位。要让机械装置足够快速、准确地移动样本以跟上高速激光器的频率并非易事。布鲁克通过摆脱传统思维的束缚，采用固定样品靶板的位置，而移动激光器的方法，充分实现了10 kHz激光器的潜力。

此外，在检测器设计方面的一项成果值得注意，即在学术上广受好评的动态和谐ParaCell ™被整合到了solariXTMXR 系统。由莫斯科俄罗斯科学院Eugene Nikolaev 教授和他的同事们共同开发的ParaCell ™创新设计技术，可以在宽质谱范围内稳定离子回旋共振信号。在不要求高通量时，solariXTM XR 是可以获得千万级分辨率的质谱仪器。此外，该仪器还能在更高采集速率下提供分辨率大于250000（m/z 400 / 1s / 7T）的基准测试性能。 承载多项创新技术的solariXTM XR近乎完美的满足复杂混合物MALDI成像的要求，是一台迄今无可比拟的质谱仪。

当要求质谱仪以超出常规的速度进行常规分析时，快速分析面临的挑战包括仪器的控制、数据的采集和数据处理程序等都是需要重点考虑的因素。与传统MALDI仪器不同的是，如今新一代质谱系统为了满足超快的分析速度，会采用诸如并行计算线程等策略。

实践中的创新：

为了满足药物超高通量筛选（uHTS）检测方案的需求，布鲁克研发人员采用上述新技术， 成功的将rapifleX MALDI PharmaPulseTM仪器打造成测样速度比传统仪器快20倍，性能更稳健、检测更灵敏，质量范围更宽的高端MALDI-TOF 质谱系统。

2016年美国质谱年会（ASMS）期间，来自英国葛兰素史克制药公司的Peter Marshall博士等研发人员以墙报的形式，展示了他们如何通过将MALDI-TOF质谱仪与纳升液相色谱仪相结合，每周完成100万以上样本筛选。这项工作在配备了10 kHz激光器的布鲁克MALDITOF质谱仪上进行。实验条件：m/z 80 -400 或700 – 3500质量范围，每个样本的激光轰击数为200次。该系统可在7.36分钟内完成1536孔靶板的测定（也就是1536个样品!）。如果要处理更庞大数量的内部候选化合物，通过简单计算可知，分析200 万种化合物仅需要7.85天。整个方案的稳定性评估表明，108次测定前后的结果具有良好的相关性。

图1 - TOF / TOF 质谱（2）的离子光路

他们的结论是，uHTS（超高通量筛选）技术和方法不仅稳定，而且分析速度非常快。该小组每周测定超过100万个样本，并且发现即使测定超过200万样本也无需清洗离子源。最后，为实现更高的通量，该小组还使用6144孔板取得了类似的检测结果。如果纳入常规应用，这将使筛选200万种化合物所需时间缩短至2.39天。

相比之下，如果需要利用MALDI质谱成像（MALDI MSI）技术探明模型组织内的药物及其代谢产物分布，那么布鲁克 solariX 质谱系统是最佳选择。传统的方法是通过采用定量全身放射自显影法（QWBA）或液质联用（LC/MS）分析法来获取药物分布和代谢。但两者都存在不足。QWBA是一种功能强大的技术，所生成的数据为世界各地的监管机构所接受。但是QWBA 得到的是总放射性，其中可能包括原型药物、代谢物、杂质和降解产物等放射计数的总和。因此，QWBA对于研究人员希望探寻药物在体内的生化途径和代谢机理的需求，QWBA存在严重的局限性。

LC/MS分析的对象是组织匀浆提取物。这项技术无法显示任何空间信息，更为严重的是，可能会产生误导。例如，如果组织中的某个分析物在局部高度集中，提取与均浆过程将会产生稀释作用，从而掩盖了该分析物局部高浓度的真相，而得出相对较低浓度值，有时甚至会低于检测限。如果药物或代谢物出现局部蓄积，通常表明该药物可能存在毒性，测定组织匀浆提取物往往无法准确定位药物在组织中的分布。另外，如果来自组织匀浆的某项分析物被确定具有较高浓度，研究员则可能得出错误的毒性结论，因为研究人员可能会认为该药物应该是均匀分布于整个组织。

与LC/MS方法截然不同，MSI方法采用常规组织切片作为待测样品。首先用基质覆盖组织切片，这样不仅可以将组织中的化合物分子提取到组织表面，而且仍然保留了这些化合物在组织中的空间关系。组织切片样品制备就绪后， 用MALDI-TOF质谱测定。检测结果为具有空间分辨特性的质谱图。因为激光仅轰击到组织切片表层的基质结晶，底层细胞特性未受影响，所以该组织切片可以通过常规的组织染色标准程序进行染色，从而得到高质量的组织影像。将组织影像结果与MALDI 质谱分子成像信息相结合，有可能实现直接测定组织获得组织学检测结果。

最近M. Reid Groseclose等评估了用大鼠进行的抗癌药物达拉菲尼（DAB）肾毒性研究，认为MALDI MSI提供的信息达到甚至超过LC/MS。这项研究旨在支持推动DAB用于儿科患者。先前的研究发现在幼鼠身上出现了一些意想不到的不良肾影响。这些不良影响在成年鼠的研究中并未出现。（3）

图 2 - 来自 PND 7-13 幼鼠肾组织切片的质谱成像图（4）

MALDI MSI的初步试验结果就可以确定DAB 及其代谢物在肾脏中的分布（图2）。随后对肾小管沉积物进行分析，提供了沉积物的化学成分，完成了达拉菲尼用于儿科治疗的风险评估。这一评估较单独采用LC/MS 分析法的结果更为完整。

结论

制药公司正在寻求创新型方法与技术，以推动安全、有效的新药快速投放市场。正如我们所见，MALDI技术已经对小分子药物的研发产生了影响，不少行业分析人士相信，未来几年这种影响还将显著增强。MALDI技术首先应用于基础研究，随即在常规uHTS 和MSI 应用中证明其价值。所以颇具前瞻性的研究人员们正在对这种最新仪器设备进行投资并且拓展应用范围，以待在药物早期开发过程中对候选化合物获得更多的认识和更深入的了解。

参考资料

1.Pharmaprojects 2016. Pharma R&D Annual Review of 2016

2.Castellino S, Groseclose MR, Wagner D. 2011. MALDI imaging mass spectrometry: bridgingbiology and chemistry in drug development (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22074284/[Accessed 15/12/2016]

3.M. Reid Grosclose et al, 2015. Imaging MS in Toxicology: An Investigation of Juvenile Rat Nephrotoxicity Associated with Dabrafenib Administration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:887:898. DOI: 10.1007/s13361-015-1103-4 (Internet) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25804893 [Accessed 15/12/2016]

4.Groseclose, M.R., Laffan, S.B., Frazier, K.S. et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26: 887. doi:10.1007/s13361-015-1103-4