新药前沿：当高通量筛选技术遇到酶靶点

筛选技术（Screening Technologies）作为新药发现的关键技术之一，通过对靶标进行活性或亲和性的测试，进而发现潜在的靶标抑制剂或激活剂。虽然对靶标进行统计评估的方法各有不同，但是酶（Enzymes）仍然是药物发现中被关注的主要靶点类型之一。

《High-Throughput Screening For The Discovery Of Enzyme Inhibitors》的作者Matthew D. Lloyd首先对1990年至2018年期间的酶抑制剂筛选相关文献进行了统计，内容包括了筛选技术、适应症范围、靶点类型以及Assay方法四个方面。

筛选技术：高通量筛选仍然是药物筛选的主流方法

图一 1990~2018年文献报道的筛选方法统计

高通量筛选作为主流的筛选技术，已得到了广泛的应用。其他筛选技术，比如组合库 (Combinatorial Library) 和碎片化合物库(Fragment Library)筛选技术运用也相当广泛，只是相较而言运用较少。另外，基于DNA编码化合库（DEL）技术的筛选文献报道也不多见，并且大都发表于2016年之后，很多研究工作仍处于待发表状态。正如2018年Brown和Boström 所指出，The Journal of Medicinal Chemistry上所报道的66个临床化合物，就有1个是出自于DNA编码化合物库技术。

酶抑制剂对应适应症分布

图二 1990~2018年文献报道的筛选对应适应症类型统计

针对癌症和细菌感染领域的筛选占总数的2/3以上，然后依次是针对病毒、寄生和真菌感染、糖尿病、神经系统疾病等领域的筛选。在其他领域也有少量应用。

筛选酶靶点类型分布

集中分布于激酶、肽酶、蛋白酶、核苷核酸代谢酶。

图三 1990~2018年文献报道用于筛选的酶种类统计

Assay方法分布

图四 1990~2018年文献报道用于筛选的Assay方法统计

荧光检测技术是主流。

另外，作者基于2017年至2019年期间发表于The Journal of Medicinal Chemistry, ACS Medicinal Chemistry Letters以及ACS Infectious Disease中关于药物筛选与发现的文献调研，汇总了73个苗头化合物到先导化合物的筛选、优化案例（图五）并总结了先导化合物的共性：

图五 部分苗头化合物到先导化合物的优化案例

Lipinski五原则

75个先导化合物中，符合类药五原则（Lipinski’s rule of fi ve）的化合物占74%，而不符和类药五原则的分子中分子量大于500 Da约占22%，LogP大于5的约占11%。因而从统计规律来看，类药五原则在发现传统酶抑制剂药物优化和结构改性方面具有非常重要的指导意义。

特殊环系（RingSystem）出现频次高

从先导化合物的结构来看，特殊环系出现频次最多的是嘌呤结构，这有可能与激酶和其他一些基于核苷酸的酶在很多疾病中起到的巨大作用有关。其他出现频次比较高的环系包括五元环的四氢噻唑、吡唑、吡咯、咪唑啉和吡咯烷，以及六元环哌啶和哌嗪类骨架。

卤素取代有作用

在统计的先导化合物中氟原子和氯原子取代高频出现，溴原子取代也有出现。75个先导化合物中，有50个化合物含有卤素取代，整体比例达到了67%。相应的，在2018年FDA批准上市的38个小分子药物中，就有18个含有氟原子取代。

分子柔性增加

大部分的先导化合物都含有一个手性中心，更有6个化合物含有两个手性中心。从苗头化合物到先导化合物，Sp3杂化碳原子个数比例有着广泛地升高，统计上来说从0.197 ± 0.157 上升到了 0.255±0.162。

最后，作者梳理了影响苗头化合物检出率的因素。

1、Z因子（Z-factor）

Z 因子是影响苗头化合物检出率的关键因素之一。Z 因子数值越大代表着阳性对照与阴性对照在信号上的区别越大，抑或是代表着信号强度的标准偏差越小。虽然Z 因子很大程度上取决于统计学上对苗头化合物信号界限的选取，但理论上来说，Z 因子与苗头化合物的检出率是成正相关的。为了验证这一理论，作者统计了Z 因子与苗头化合物检出率的相关性，具体结果见图六。从统计来看，Z 因子的平均水平为0.775±0.071，中间值为0.8，理论上的正相关性是客观存在，这与预期也是相符的。当然，也有超预期的例子，比如图七中标红的三个点就是明显的例子。

图六 Z 因子与Hit检出率的统计

2、化合物库质量的影响

化合物库的质量包括三个方面：多样性、有效浓度、化合物库大小。化合物库的多样性制约着苗头化合物的新颖性，而化合物的有效浓度则影响着活性化合物的检出概率。因此化合物库的多样性越大，化合物的有效浓度越高意味着苗头化合物检出率更有保证。但是两者之前需要有一个平衡，一个化合物库里单一化合物簇（Cluster）维持在4~12个化合物的时候，多样性和有效浓度都能得到保障。

另外，对于化合物库大小而言，理论情况下（基于多样性、有效浓度以及靶点的成药难度基本一致的随机筛选而言），大的化合物库有利于发现更多的苗头化合物。但是基于此次有限的汇总数据来看（仅有4个化合物库达到了百万级（0.6M~1.8M）），定向化合物库（Focus Library）（图七中红色圈部分）由于其自身的特点检出率较好，而大的化合物库并没有带来更高的苗头化合物检出率以及更高质量的苗头化合物（图七）。

图七 化合物库大小与苗头化合物检出率的规律统计

3.泛筛选干扰化合物（Pan-AssayInterference Compounds）和化合物聚沉（Compound Aggregation）。

在Assay中，很多化合物展现出来的“活性”仅仅是一种假阳性结果—它们的“活性”并不是基于化合物分子与蛋白质之间特异性的作用。真正的药物能够精确作用于特定蛋白质的结合位点，从而抑制或激活蛋白质的功能。而“假阳性化合物”则伪装成药物结合的样子，在各种筛选研究中大放烟雾弹。科学家们把这些”坏家伙”叫做泛筛选干扰化合物（Panassay interference compounds，被证实为泛筛选干扰化合物的结构详见图八），简称PAINS（这个缩写可谓物如其名，它们真是研究人员的心头痛）。

基于泛筛选干扰化合物的非特异性抑制而导致假阳性概率升高的主要机制是化合物聚沉（Compound aggregation）。化合物聚沉的主要表现是对多组分、非关联的酶表现出抑制活性，其特点包括有时间依赖性、计量反应曲线具有高的希尔系数、构效关系不明确等特点。因此，药物研发人员应当提高警惕这些假阳性化合物，并且仍要注意一点，那就是在药物筛选试验中表现出最强活性的化合物未必是最合适的研究对象。

4.Assay检出方法的选择

正如之前提到，在高通量筛选中Assay的检出方法有很多，用于衡量酶活性最多的当属于荧光检出法和吸光度检出法。这两种方法都能非常便捷的与高通量进行匹配。但是这两种检出方法也有不适用的场景，比如吸光度检出法，在终点法测定（endpoint assay）时，如果化合物库的吸收低于~410 nm，实验的背景吸收会引入假阳性（false-positive）和假阴性（false-negative）结果。虽然假阳性结果可以通过动力学Assay或者验证Assay来解决，但是由于微量定量板有位于340~410 nm的强吸收，所以仍旧会导致Z 因子降低，直接结果就是较弱活性的苗头化合物将很难被筛选出来。而对于荧光检出法而言，自发荧光化合物库或者具有光敏特性的化合物库同样会遇到假阳性和假阴性结果。在某种程度上，选择合适的检出方法可以减少甚至避免上述问题，比如使用更长波段的光源，对于荧光检出来说，>500 nm会是比较好的选择。

图八 造成筛选假阳性的“罪犯”们（图片来自：Nature 漫画作者：Roz Chast）

结语

作者通过对酶抑制剂的高通量筛选的总结，揭示了当下的新药发展的病症主要围绕癌症、细菌感染和病毒感染，研究靶标也以激酶、磷酸化酶、肽酶等为主要的研究点。作为当下主流的Assay方法，基于荧光的Assay在新药发现中起到非常重要的作用。作者还通过对73个苗头化合物到先导化合物的优化和结构改性案例分析，印证了类药五原则的重要指导意义，也提炼了特殊环系在新药发现中的重要作用。另外，也总结了影响苗头化合物检出率的其他重要因素，包括Z 因子、化合物库质量、假阳性化合物的甄别以及选取合适的Assay检出方法。这对药物筛选和后期优化，具有非常大的指导意义。

另外，文中还提及到，此次统计的筛选案例中有且仅有4个化合物库达到了百万级（0.6M~1.8M），这也意味着大型化合物库（百万级），甚至是超特大型化合物（亿级）的筛选数据有待进一步汇总。作为一项新兴的 “高通量”技术，DNA编码化合物库技术在大型甚至超大型化合物库筛选方面体现了明显的优势。我们期待更多基于DNA编码化合物库技术的报道，也期待更多基于大化合物库的筛选数据积累。

关于成都先导药物：

成都先导药物开发股份有限公司HitGen Inc.是一家快速发展的生物技术公司，总部位于中国成都，在美国设有子公司。公司为小分子新药发现建立了一个以设计、合成和筛选为核心的DNA编码化合物库的技术平台。

本文作者：成都先导冯静博士与技术团队

英文原作出处：MatthewD.Lloyd.HighThroughputScreeningForTheDiscoveryOfEnzymeInhibitorsDOI:10.1021/acs.jmedchem.0c00523