化妆品抗皱功效评价概述

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发布时间:2020年1月16日下午 09:01:34

皱纹是衰老的一种表观现象。
皱纹是衰老的一种表观现象。对于健康人群而言,皮肤老化形成肉眼可见的皱纹、松弛下垂是一个长期而复杂的过程,有内源性因素和外源性因素。关于内源性因素存在很多学说,如自由基学说、基因学说、线粒体DNA损伤积累学说等。外源性因素包括阳光,污染,饮食习惯,生活规律,压力和情绪,肌肤菌群等,其中阳光中的紫外线辐射带来的光老化是皮肤衰老的最重要影响因素[1]。一般来说,随着年龄的增长,角质形成细胞和成纤维细胞活性降低、胶原蛋白松垮稀疏、弹性蛋白断裂无序、透明质酸及蛋白聚糖含量减少,皮下组织的脂肪不断地流失,原本充盈的脂肪层坍塌下移,皮肤真皮连接部逐渐趋于平坦,表皮、真皮厚度逐渐变薄。这些微观的组织学改变,在宏观上表现为皮肤表面的凹凸不平、松弛。化妆品抗皱功效评价主要是针对健康人群衰老的微观变化和表观现象两个角度进行研究,包括体外测试和人体测试两种方法。
 
体外测试方法主要是采用生物学方法进行内在机理性研究。
 
生物学包括通过研究化妆品对弹性蛋白酶、金属蛋白酶的抑制率,成纤维细胞数量、胶原蛋白含量的增长率,或基于三维重组皮肤模型,对表皮层、真皮层、细胞外基质层(含胶原纤维)的影响来评价其抗皱功效。
 
抑制弹性蛋白酶实验通常是研究活性成分对猪胰腺弹性蛋白酶IV型与底物N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pnitroanilide催化反应的抑制作用,抑制率大小通过吸光度变化反映。Kim[2]等用Tris-Cl缓冲液配制成底物N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide,然后加入猪胰腺弹性蛋白酶,25ºC条件下孵育10min后,在410nm下测定吸光度。研究发现莲的叶、种子和花提取物对弹性蛋白酶的抑制率可达50%左右。
 
抑制基质金属蛋白酶(MMP,Matrix Metallo Proteinase)的实验方法有荧光底物法、酶联免疫测定法、明胶酶谱法、高效液相色谱法、毛细血管电泳法等。王艳春[3]等将基质金属蛋白酶1uL和不同浓度的覆盆子提取物1uL加入到缓冲溶液中,体积为50uL;对照组不加入覆盆子水提物溶液;用荧光酶标仪检测荧光强度,计算出不同浓度覆盆子提取物对MMP-13的抑制百分率。结果显示覆盆子水提物浓度与MMP-13活性抑制百分数呈正比关系,说明覆盆子水提物具有抑制MMP-13活性的作用。
 
成纤维细胞体外实验可以选择正常细胞,也可采用经紫外线或H2O2处理的损伤细胞,然后在一定浓度的化妆品或功效成分存在的条件下培养,再研究成纤维细胞的体外增殖能力,或用酶联免疫吸附测定法(ELISA,Enzyme Linked Immunosorbent Assay)和蛋白质印迹法(Western Blot)杂交检测胶原含量的变化。马慧敏[4]等用胶原寡肽处理成纤维细胞后96、120小时,细胞增殖活性显著增加,1.00mg/ml作用最显著,说明胶原寡肽可以促进成纤维细胞增殖。Chiang[5]等使用302nm、40mJ/cm2的UVB照射人皮肤成纤维细胞15s后,添加勾藤水提取物培养一段时间进行MMT实验,抑制基质金属蛋白酶和总胶原蛋白含量测定,发现勾藤水提取物能降低MMP-1,MMP-3,和MMP-9的表达,促进胶原蛋白的生成。
 
三维重组皮肤模型包含上表皮模型,真皮模型,以及由表皮层、真皮层和细胞外基质层(含胶原纤维)构成的全层模型。实验时可将人造皮肤模型在含功效物质的条件下培养,或将功效物质配方涂抹于人造皮肤模型上,通过测定细胞活性来评价功效物质的效果。Sok[6]等通过三维重组皮肤模型实验,研究发现C-木糖苷可以增加老化皮肤的葡萄糖胺聚糖表达,增加I型前胶原和原纤维蛋白I的合成,进而诱导VII、IV型胶原和层粘连蛋白5的合成。
 
抗皱化妆品属于功效性护肤品(Cosmeceuticals),回想起功效性护肤品行业创始人AlbertM.Kligman的三个经典问题:1.成分和配方的作用机制清楚吗?2.能透皮吗?渗透性怎样?3.有临床观察结果吗?体外测试方法通常适用于进行大量活性成分的筛选,并且可以更好的研究活性成分的内在作用机制,但要检验化妆品抗皱的实际效果,还是需要考虑实际的透皮吸收性,并进行双盲安慰剂对照组人体试验来验证。目前,人体试验评价方式主要有皮肤组织活检方法、皮肤科医生的临床评价、光学成像分析技术和皮肤弹性无创检测手段。
 
皮肤组织活检方法
 
皮肤组织活检方法需要采集实验前后的皮肤组织样本,固定染色后使用高倍显微镜或者电镜观察皮肤角质层形态,真皮层的胶原新生情况、弹性纤维和成纤维细胞的改变,血供和局部血液循环的改善等[7]。RezaKafi[8]招募了36位平均年龄87岁的受试者开展了随机双盲对照组的临床试验,在手臂内侧区域单侧使用0.4%的视黄醇乳液,对侧则使用安慰剂。每周3次,连续24周。最终有23位受试者完成了全部测试。试验前后取4mm厚的皮肤组织样本,染色后使用免疫组织学分析,可以看到使用视黄醇乳液24周后真皮层乳头层的胶原1(胶原1占真皮层胶原的85%,是主要成分)显著增多。另外,影像学结果也显示肉眼可见的皱纹显著减少,皮肤变光滑。因此得到结论视黄醇(维生素A)可以改善自然老化肌肤。皮肤组织活检方法属于有创型检测手段,实际中化妆品公司应用较多的是无创型的检测方法。
 
临床评价
 
一般来说,化妆品抗皱功效临床评价是指皮肤科医生基于由相同拍照设备、放大倍率、照明条件、对象位置得到的标准化照片对特定研究对象进行临床评分,可以是皮肤科医生直接对研究对象的皱纹表观特征进行评价,也可以是定量评价通过标准化方法采集研究对象的照片。目前,应用广泛的标准化照片有日本香妆协会发布的和《皮肤老化图谱》(亚洲人第二册)中刊登的眼角皱纹等级照片。
 
Katsuko Kikuchi[9]采用了随机双盲对照的实验研究每晚使用一次视黄醇的方案对中年日本人进行轻度光老化的改善情况。在57位受试者中进行了为期26周的研究,受试者的面部两侧各涂有0.075%视黄醇乳霜及安慰剂。在研究开始时以及第4、8、12、18和26周后,由受过训练的皮肤科医生进行临床评估。在进行临床评估之前,要求志愿者使用规定的清洁剂清除化妆,然后对细纹,深纹等参数进行评价。等级量表包括以下等级:0(无变化),1(略好),2(更好)和3(好的多)。26周后,皮肤科医生的评价结果显示视黄醇一侧的光老化改善率更高。
 
J.J.J.Fu招募了196名女性志愿者[10],进行了随机对照实验研究了含烟酰胺/多肽/视黄醇丙酸酯的化妆品膏霜组与0.02%维A酸组相比对皱纹的改善情况。皱纹程度按照文章提供的标准图片进行打分,根据该标准,入选志愿者的皱纹介于3.5-4.5级之间。专家对皱纹的评分显示,8周与24周后两组之间无显著差异,含烟酰胺/多肽/视黄醇丙酸酯的化妆品膏霜组甚至在8周时效果超越了维A酸组。
 
光学成像分析技术
 
随着光学成像及分析技术、超声波技术的日益成熟,我们不仅可以采集研究对象的表观形貌的二维、三维图像,还可以借助高频超声波测试仪、共聚焦激光扫描显微镜、双光子激光扫描显微镜、核磁共振成像仪器、光学相关断层成像等仪器观察和拍摄人体不同皮层的微观结构,并分析真皮层厚度、致密度、胶原和弹性蛋白含量。
 
目前,应用较多的人体面部皮肤采集及分析技术有接触式三维硅胶复膜法,面部图像分析仪VisiaCR(美国Canfield公司),VisioScan(德国Courage+Khazaka公司),条纹光三维成像分析系统有Primos(美国Canfield公司),FOITS(Fast Opticalinvivo Topometry of HumanSkin)和DermaTOP-HE(法国EOTECH公司)等。
 
接触式三维硅胶复膜法采用的是聚合软硅橡胶(如英国Flexico公司的Silflo)印制皮肤复膜(阴膜),然后用不同的仪器和软件对复膜结构进行数据处理,分析皮肤皱纹的变化。可以是直接测量皮肤阴复膜,也可以通过较硬材质(如环氧树脂)把阴复膜印成阳复膜,再进行测定。早期采用机械参数评估皮肤皱纹的仪器有粗糙度试验仪(Hommel TestT20,德国Hommel公司)和轮廓仪(Stylusprofilometer,德国Mahr公司),目前应用较多的是光学形貌测量技术,常见仪器有激光形貌测定仪(Laser Profilometry,德国UBM Messtechnik公司)和皮肤图像测定仪(SkinvisiometerSV500,德国Courage+Khazaka公司)等。Robert[11]等采用皮肤复膜显微图像分析技术对20名使用含多糖的抗皱霜的志愿者进行了为期4周的研究,研究结果表明使用了抗皱霜4周后,超过65%的受试者皱纹得到了显著改善。现今由于非接触直接测量技术的出现,使用硅胶复模测量技术显得有些烦琐。
 
袁超[12]等用临床主观评分、专业用数码相机(Fujix,DS505,日本)和Photoshop7.0软件、VisioScanVC98软件3种方法对481名中国女性面部皱纹进行评估,主观评分将481张图像分为9个等级,使用Photoshop和Visio ScanVC98软件对9个等级的图像进行分析得不同参数,最后统计各个参数与主观评分的相关程度。结果显示主观评分与Photoshop中的直方图中间值、Level值、SD值及VisioScan的SELS分析得到的参数均有较好的相关性,说明主观评分、Photoshop软件评价、VisioScan评价,这3种方法均能从一定程度上反映皮肤老化情况,可适用于人体皱纹评价。
 
王曦[13]等使用医生评分,Primos,VISIA-CR和F.A.C.E.S图像分析软件(FacialAnalysisComputerEvaluationSystem,Amway)对复合维生素A霜剂进行了为期24周的临床评估,包括眼角、额头、眉间皱纹测量,其中Primos选择了Ra,Rq,Rmax,Rz4个参数,测试结果表明医生评分,Primos,VISIA-CR和F.A.C.E.S这3种不同分析方法得到的结果呈现一致性。
 
祁彦[14]等采用FOITS对使用产品前后的皮肤纹理进行测量,通过Rz、Ra(Rz、Ra为皮肤纹理参数)和深度分布频率(FDD,frequencydistributionsofdepth)三个参数对15种产品的抗皱效果进行评价,每款产品在24名健康女性志愿者面部进行为期4周的试用,采用半脸、空白、随机对照实验方式,对使用前和使用4周后数据进行统计分析,其中Rz、Ra值采用ANOVA分析,FDD值采用非参数检验方法统计分析,实验组和空白对照组的初始值和终末值采用匹配Wilcoxon秩和检验,实验组和空白对照组之间差异的显著性采用Mann-WhitneyU检验。试验结果显示使用4周后,6款产品有明显抗皱效果,其中2种产品改变皮肤轮廓深度和皮肤表面皱纹深度频率分布。该方法可用于客观、直观的反映化妆品的抗皱效果。
 
S.Nouveau-Richard[15]等对比了220MHz的超声波成像技术和共聚焦显微镜Viva-Scope1000(LucidInc.,Rochester,NY,USA)的成像技术在测量皮肤表皮机构的差异,该研究指出,共聚焦显微镜Viva-Scope1000不适用于手掌心这类表皮较厚的区域,220MHz的超声波成像技术不适用于测量如前臂内侧这类表皮较薄的区域,这两个均可以测量手背区域的表皮结构,通过对该部位的测量结果显示由于共聚焦显微镜Viva-Scope1000的测试区域小导致其测试结果的重复性不佳,220MHz的超声波成像技术得到的表皮厚度(15mm)大于共聚焦显微镜Viva-Scope1000(400um)的结果,原因在于前者得到的表皮厚度包含表皮的乳突结构。在实际研究中可参考这两种仪器的结果进行综合评价。
 
Leveque[16]等使用光学显微镜、共聚焦扫描和组织活检等分析方法研究证明一种水杨酸之类衍生物(C8-lipohydroxyacid)可以使表皮基底层的增厚20%。
 
皮肤弹性无创检测
 
皮肤弹性无创评价技术主要是通过皮肤生物机械学改变来测量化妆品对皮肤弹性的影响,是一种无创技术。常见方式有吸力法,扭力法、压力法和测量弹性切力波传播速度。相关仪器有吸力原理的皮肤弹性测试仪(CutometerMPA580,德国Courage+Khazaka公司)、扭力弹性测试仪(Ballistometer,英国Diastron公司)、压力原理皮肤拉伸弹性测试仪(Elastimeter,芬兰Defin公司)、可测量弹性切力波传播速度的皮肤粘弹性测试仪(VESA,Viscoelasticity SkinAnalyzer),其中Cutometer MPA580在化妆品功效研究中应用较为广泛。
 
吸力法是在被测皮肤表面产生一个负压,再通过一个非接触式光学测试系统测得皮肤被吸起的高度,进而得到皮肤被拉伸的长度随时间变化的曲线,通过该曲线可以得到一系列参数来表征皮肤弹性。Takema[17]等使用Cutometer通过对170名女性面部和前臂皮肤厚度、皮肤弹性进行了测量,得到的结果显示该方法得到的皮肤弹性参数基本不受皮肤厚度的影响,与年龄、日晒存在相关性,适用于皮肤老化研究。DiQu[18]等人研究了健康女性的皮肤弹性与年龄的关系,对Cutometer的参数做了补充,在原有线性弹性参数基础上,结合皮肤被拉伸的长度随时间变化的曲线,开发了面积参数,并用于抗老化妆品功效研究中。
 
扭力法是在受试皮肤表面产生一个扭力,通过一个旋转传感器记录扭转角度、速度,从而得到角质层弹性参数。GregorB.E.[19]等研究发现扭力弹性测试仪Ballistometer适用于皮肤硬度、柔软度测试。
 
测量弹性切力波传播速度是在受试皮肤表面产生一个切线震荡频率形变,压电结构探头将信号输送到接收器,切力波传播速度则由从传送器到接收器的时间计算出。AkivaVexler[20]等研究发现弹性切力波传播速度的皮肤粘弹性测试仪适用于测试较硬皮肤的粘弹性和皮肤的各向异性。
 
现在越来越多的中国消费者关注化妆品的黑科技,甚至成为成分党。根据Mintel的市场报告[21],有62%的中国女性消费者想要找到更高浓度的和更高效的成分来改善她们的皮肤,而抗皱和抗衰老是消费者永恒的追求。建立科学合理的化妆品抗皱功效评价体系可以提高企业对延缓衰老的化妆品的研发水平,满足消费者对更高品质的抗衰老化妆品的诉求。
 
为更好的研究活性成分的内在作用机制,通常会采取生物学、细胞学、重组皮肤模型等体外实验手段,同时体外实验也可方便快捷地进行大量活性成分的筛选,为今后更多大规模的人体实验提供基础。人体试验评估方法包括皮肤组织活检方法,影像学,和皮肤弹性无创检测技术等,需要设计合理的双盲安慰剂对照组实验,并且有科学的统计方法和统计学结果,保证数据的有效性和可重复性,人体实验证据可以更好地验证化妆品或原料的抗皱功效。综合这两种试验方式可以更全面阐明化妆品由内而外的抗皱效果。
 

 

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