化妆品的微生物污染及防腐效能试验方法对比

化妆品中富含多种营养基质，包括糖类，蛋白质， 氨基酸，维生素，醇类，胺类，脂肪，无机盐，水等。 不但能够提供微生物生长所需的丰富的碳源、氮源等营养成分,非常利于微生物的生长和繁衍。微生物污染化妆品后, 一方面会对化妆品的品质造成损害, 可能表现为 外观色泽、气味的改变, 乳化体系、增稠体系的破坏, 失去功效等; 另一方面是对消费者的健康造成损害, 表现为对皮肤的刺激，以及引起疾病。微生物的特点是种类繁多，繁殖速度快，分布广泛和容易变异。由于微生物的这些特点，使得它存在于我们生活着的每一个角落，也导致了化妆品微生物的污染是多种多样的，为化妆品的生产和保存带来了困难。化妆品微生物的污染源除消费者使用过程中带来的污染，还源于化妆品原料，产品包装以及生产设备上的残留物。为预防化妆品受到微生物污染，现在主要的方法是在产品中添加适量的防腐剂， 以抵御微生物的一次污染和多次污染。而且要通过防腐功效测试实验对防腐效能进行有效的评估，以判断防腐体系是否足够耐受微生物的污染。

目前国内外使用较多的防腐功效测试实验，即微生物挑战性试验，主要有：盥洗用品和香料协会(CTFA)、 欧洲药典(EP)、美国药典(USP)、美国检验方法及材料协会(ASTM E-640)、国际标准化组织（ISO 11930- 2012）等推荐的方法。微生物挑战性试验的基本原理是在化妆品中加入一定量的微生物，定期检测微生物生长情况，以此判断防腐剂的防腐效能。不同的国家、不同的组织采用的测试菌种、接种方式和接种次数、接种浓度和接种量、检测周期和评价标准等都有一定的差异。接下来，笔者整理了这些标准方法的共同点和不同点。

1. 防腐功效实验选用的测试菌种

防腐功效实验中，测试菌种的选择非常重要，选择原则一般应包括革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，酵母菌，霉菌，这几类微生物中每类至少选一种。另外还可以选择产品生产、储存和使用过程中可能污染的微生 物，这些污染的微生物能反映实际环境的污染状况，加入到防腐功效测试，一定程度上能更加有效地评价防腐体系的抑菌性能。近几年检出频率较高的污染菌有革兰氏阴性杆菌（日沟维肠杆菌、沙雷氏菌、克雷伯氏菌、 洋葱伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞杆菌、阴沟肠杆菌， 其中日沟维肠杆菌检出率最高），革兰氏阳性球菌（藤黄微球菌、人葡萄球菌检出率最高），芽孢杆菌（蜡样芽孢杆菌、高地芽孢杆菌，主要在包材中检出）等。以下是 5种防腐功效测试标准的菌种选择及原则：

2. 接种方式和接种次数

在测试产品中引入特定的微生物的方式分为两种① 混合培养法②纯培养法（单一培养物）。混合培养法的优势是比较便捷，工作量小，通过一次挑战测试就能完成几种菌株的测试，模拟实际环境中微生物杂居的特点， 缺点是不能有针对性的测试对每一种菌种的抑制效果。 纯培养法的优势是能够有针对性的测试防腐体系对每种测试菌种的抑制效果，更全面的评估防腐体系，缺点是一份试样仅测试一种菌，一个样品要分多份试样测试， 工作量较大，测试情况不能完全模拟自然环境。接种次数主要是一次加菌，特殊情况可多次加菌。一次加菌较适用于一次性使用产品，多次加菌较适用于容易被消费者反复接触而污染的产品，而且多次加菌对防腐体系的抑菌能力要求更为严格，一定程度上需要增加防腐体系的用量。以下是5种防腐功效测试标准中推荐的接种方式和接种次数：

用于消费者反复接触污染的产品类型，可在28天内继续进行二次加菌试验，即在21天或28天时重新对试验样品进行称重和二次加菌，并在28天内继续进行试验。

3. 接种浓度和接种量

测试菌种用每种特定微生物最适的培养基培养后， 用无菌生理盐水分散和转移菌种（黑曲霉用无菌生理盐水和吐温80混合液来分散和转移），再用无菌生理盐水（无菌生理盐水和吐温80混合液）稀释至特定浓度后，用于测试样品的加菌。细菌培养基推荐：胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）或大豆酪蛋白消化琼脂培养基；真菌培养基推荐：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。5种防腐功效测试标准方法中微生物接种浓度的数量级范围基本一致。具体如下表所示：

菌悬液配制时，可以通过与麦氏比浊法中的比浊管比对，可以通过紫外分光光度计测定吸光度，可以使用血细胞仪或其他可重复的直接显微镜计数技术来初步确定菌悬液的浓度。最后，通过平板稀释法，将菌悬液梯度稀释后，平板计数确定菌悬液浓度值。

4. 检测周期和评价标准

检测周期：检测时间节点的选择，基本是7天，14 天，28天，部分标准中，会针对特殊剂型产品增加检测节点。

-艾卓实验室