含聚季铵盐-16的香体液对减少腋臭功效的研究

在动物界，气味可以触发和控制各种反应，如身体的气味用于社交[1]。然而，在现代西方社会，体味却受到相当的排斥。

体味主要源于人体为降低体温而进行的排汗，如在体力劳动和运动时，或情绪紧张、恐惧、焦虑和疼痛时。整个人体表面几乎都覆盖着不同类型的汗腺（1.6~5×106）[2]。腋窝具有大量的小汗腺（外分泌腺）和大汗腺（每个腋窝超过25,000 个）[3]。小汗腺主要负责调节体温。它们分泌由电解质、有机和无机化合物组成的液体，在腋窝中形成潮湿的环境。小汗腺的组成依身体部位不同而有所不同[4]。但是，大汗腺早在出生时已存在，并在青春期开始时产生一种含有蛋白质、脂质和类固醇的油状无味液体[5]。此外，由于大汗腺和皮脂腺都通向毛囊，所以大汗腺分泌的汗液很可能混有皮脂[2,6]。

人类腋窝的形状独特，它能够形成一个温暖潮湿的环境。在这种潮湿的环境中，细菌可以大量生长繁殖[7]。腋窝菌群主要由葡萄球菌，有氧棒状杆菌，丙酸杆菌和微球菌四大类组成[8]，其中葡萄球菌和棒状杆菌是最重要的类型。这些细菌将大汗腺分泌的无味汗液分解成人体挥发性气味难闻的物质[9]，而小汗腺分泌的汗液仍无臭味。

在生化水平上，短链和中链挥发性脂肪酸，硫代醇和少量的16-雄烯类固醇导致腋臭。具体来说，棒状杆菌将Na- 酰基谷氨酸水解成中链（C6-C10）挥发性脂肪酸，如（E）-3-甲基-2-己烯酸（3M2H）和3- 羟基-3-甲基己酸。葡萄球菌代谢支链脂肪族氨基酸形成短链（C2-C5）挥发性脂肪酸，棒状杆菌和葡萄球菌从L-半胱氨酸和L- 半胱氨酰甘氨酸缀合物生成硫代醇[9-11]。此外，还有证据表明，腋臭受遗传因素[12] 和种族血统的影响[13]。

含大量有氧棒状杆菌的腋窝具有强烈的体味，而葡萄球菌占主导地位的腋窝则显示较弱的气味[7,14,15]。有趣的是，女性多为葡萄球菌主导型，而男性多为棒状杆菌主导型[16]。在不同个体之间，腋窝菌群多样性很普遍。一个人的左右腋窝之间也可以检测到轻微的不同[17]。

身体或腋窝的臭味减少可以增加自信和自我感知方面的吸引力[18]，有助于增加社会信心。人类可通过不同的方法实现减少腋臭：抑制细菌生长，防止汗液分泌，抑制酶菌反应，吸收汗液和臭味及中和气味[19]。

通过预防或限制细菌生长来防治腋臭形成最为常见[20]。考虑到全球对有效和皮肤体验舒适的香体液日益增长的需求，我们研究了阳离子聚合物的抗菌活性。我们进一步研究了抗菌效果最好的聚合物（聚合季铵化合物）的抗菌防臭功效。这种聚合季铵化合物（分子质量约40,000~400,000）不渗透皮肤[21]，因此这种新型香体液配方同时具有抗菌活性和皮肤相容性。

材料和方法

研究开始前，所有志愿者对腋窝环境标准化处理（研究Ⅰ：5天；研究Ⅱ：7天）。一种特殊无味的标准皂（Baktolin? Basic Pure，pH 5.5；Bode Chemie）被提供给志愿者，用来消除腋窝中的残留难闻物质。研究开始前和整个研究期间，志愿者禁止使用止汗剂或香体液和化妆品。测量前24小时，志愿者禁止食用辛辣食物。测量前5天（研究Ⅰ）或1天（研究Ⅱ），禁止进行桑拿洗浴，游泳及剧烈体育运动。处理和测量的间隙，受试者禁止使用肥皂和除臭产品。

研究Ⅰ

测试香体液配方

DEO1：DEO1是含有1.0％ PQ-16的含香微乳液。它包括水，异硫氰酸酯-20，石蜡油，丁二醇，异硬脂酸甘油酯，甘油，香草，PQ-16，马鞭草提取物，贝类提取物，海藻油，丙二醇，PEG-10二硬脂酸酯，EDTA三钠，芳樟醇，香茅醇，香叶醇，苄醇，α-甲基紫罗兰酮和柠檬烯。

DEO2：DEO2是一种市面出售的香体液，宣称24小时防止身体异味（Rexona Women Shower Clean）。DEO2含有醇类，水，羟丙基纤维素，香脂，二氧化硅，α-甲基紫罗兰酮，苄醇，水杨酸苄酯，丁基苯基甲基丙酸，香豆素，肉桂酸己烯酯，柠檬烯和芳樟醇。

DEO3：DEO3与DEO1的含香微乳液成分相同，但含有10％ACH，不含PQ-16。

体内菌群评估

我们建立两个组对DEO1 的抗菌作用进行体内研究：（1）对17名志愿者（9女8男，21~59岁） 评估比较DEO1和DEO2的功效；（2）对20名志愿者（11女9男，21~61岁）评估比较DEO1和DEO3的功效。对照组单组进行研究，对配方进行盲测。在基准时刻，所有受试者显示腋下菌数＞ 104。

受试者有两个测试区域，每个腋窝一个，约10×10厘米。处理（分别为DEO1和DEO2或DEO1和DEO3）位置随机分配。

确定基准线数值后，志愿者清洗腋窝30秒后彻底干燥。根据ASTM标准E1207-14[22]，随后使用约500mg（正常条件下使用香体液的剂量[22]）的DEO1，DEO2或DEO3分别涂抹于左右腋窝，随后干燥4分钟。

腋窝菌群的测定

我们在受试者使用香体液前及之后1，2，4，24和48小时对腋窝进行菌群抽样。我们使用磷酸盐缓冲液清洗腋窝指定区域，并在冲洗液中测定总细菌数。

首先，将聚四氟乙烯环（直径2cm）放在腋下皮肤上，并装入1mL 0.067M磷酸缓冲液（pH 7.9，含有0.1％ Triton X-100）。然后用塑料铲摩擦皮肤表面1分钟[23]。随机选择腋窝不同位置（上，中，下）在每个时间点对细菌取样。

为测定菌群形成数量，将0.2mL冲洗液用0.8mL中和培养基稀释。放置在80g AC培养基（All Culture Broth）中的中和介质由37g L-1 心脑浸液，5g L-1D（+）葡萄糖（均来自Merck）和1mL L-1 Tween-80 组成，其中含有2.4g Tween-80（Merck），0.24g卵磷脂（Alpha Aesa）和0.08g组氨酸（Merck）。之后，将0.1mL稀释液置于含有5％绵羊血和1％ Tween-80（均来自Media Products Groningen）的哥伦比亚琼脂平板上。37℃恒温孵育48小时后，使用Countermat Flash Spiral Plater（I ＆ L Biosystems GmbH）计数菌群数目，并计算总菌群数量。

研究Ⅱ

我们使用一组训练有素的评估人员研究DEO1在减少腋臭方面的功效性。研究分两部分：A）研究比较DEO1与DEO2和基准值；B）分析比较DEO1与DEO3和基准值。对照组研究随机进行。

所有参与研究志愿者（A部分35名，B部分38名）均完成研究。但受试者必须在24和48小时的基准值测量时显示最低腋臭强度（嗅觉评分≥ 2.0）（表1）。不是所有受试者都达到这个标准，因此并非所有数据都可用于分析。A部分，24小时，28名受试者符合标准（12女16 男，22~64岁）。48小时，34名受试者符合标准（15女19男，19~64岁）。B部分，24小时，29名受试者符合标准（12女17男，21~62岁）。48小时，31名受试者符合标准（13女18男，19~63岁）。

表1. 直接鼻闻评估的腋臭强度分级

定量直接鼻闻测试

预处理阶段后，志愿者使用无味标准肥皂清洗腋窝30秒。之后，一只腋窝用DEO1处理，对侧腋窝用DEO2或DEO3处理（处理位置随机分配）。

评估人员在24和48小时后通过直接鼻闻评估腋臭强度。六名训练有素的小组成员（4女2男）依据从0（无腋臭）到5（非常强的腋臭）（表1）的范围评估腋臭强度。评估成员每年接受两次培训[24]。确定基准值后，志愿者立即用无味肥皂清洗腋窝30秒。然后研究人员将约500mg的香体液涂抹于指定腋窝[22]。香体液处理24和48小时后再次评估腋臭强度。

统计

基于双侧假说检验，我们选择0.05的显著性水平进行统计学分析，使用Microsoft Excel和SAS软件包。

体内菌群评估

细菌计数经对数（log10）转化表示为原始数据，并使用Wilcoxon 符号秩检验进行比较。

通过感官（鼻闻）评估确定香体液减少腋臭的程度。

评估前，先对每个受试者的所有鼻闻评估值算数平均值作为“原始腋臭分数”。因为这些数据需要进行正态变换，所以我们对原始腋臭分数经Blom转换后的序数进行分析。我们通过分析协方差来评估处理效果。为与基准值比较，我们进行了方差分析。

结果

研究数据显示，三种香体液在受试者中的耐受性良好。

体内菌群评估

为确定使用香体液处理后，（i）DEO1与DEO2相比和（ii）DEO1与DEO3相比，腋窝细菌减少的数量，志愿者在基准时刻t0和使用香体液处理后1，4，8，24和48小时对双侧腋窝菌群进行测定。

组1中，与基准值相比，使用DEO1处理1小时（P=0.0001），4小时（P≤0.0001），8小时（P ≤ 0.0001）和24小时（P=0.0079）后，log10细菌计数显著降低。经DEO2 处理1 小时（P=0.0008）和4 小时（P=0.0008）后，log10细菌计数显著降低。而在24小时（P=0.0150）和48小时（P=0.0011）后，log10细菌计数显著升高（图1A）。

组2中，与基准值相比，经DEO1处理1小时（P≤0.0001），4小时（P ≤0.0001） 和8小时（P≤0.0001）后，log10细菌计数显著降低。经DEO3处理1小时（P≤0.0001），4小时（P=0.0003）和8小时（P=0.0003）后，log10细菌计数也显著降低（图1B）。

图1. 体内菌群评估：（A）与基准值相比，使用DEO1 和DEO2 的腋窝细菌减少程度。（B）与基准值相比，使用DEO1 和DEO3 的腋窝细菌减少程度。腋窝菌群在基准时刻（t0）和使用相应香体液1，4，8，
24 和48 小时后被测定。数据表示为平均log10 细菌计数± 标准差。相对于基准值的显著性差异标有星号[*P ＜ 0.05；A：n=17；B：n=20（1，4，8，24 小时），n=19（48 小时）]。虚线表示DEO1，DEO2
和DEO3 的基准时刻（t0）log10 细菌计数

如图2A所示，组1结果表明，与DEO2相比，使用DEO1处理腋窝后（在所有时间点上）log10细菌计数均显著降低（1小时：P=0.0017，4 小时：P=0.0046，8小时：P=0.0001，24小时：P≤0.0001和48小时：P=0.0038）。

图2. 体内菌群评估：（A）与基准值相比，使用DEO1 和DEO2 的腋窝细菌减少程度。（B）与基准值相比，使用DEO1 和DEO3 的腋窝细菌减少程度。腋窝菌群在基准时刻（t0）和使用相应香体液1，4，8，
24 和48 小时后被测定。数据表示为平均log10 细菌计数± 标准差。相对于基准值的显著性差异标有星号[*P ＜ 0.05；A：n=17；B：n=20（1，4，8，24 小时），n=19（48 小时）]

图2B说明，与DEO3相比，使用DEO1处理腋窝4小时和8小时后，log10细菌计数显著降低（4小时：P=0.001，8小时：P=0.0484）。1小时和24小时后，DEO1也降低了log10细菌计数，然而下降程度并不显著。48小时后检测到的log10细菌计数几乎没有差异。

感官评估确定香体液减少腋臭程度

在腋臭形成的研究中，评估人员在志愿者使用香体液24和48小时后和基准时刻，通过直接鼻闻腋窝气味对腋臭程度进行评估。

图3显示，与基准值相比，使用DEO1和DEO3处理的腋窝在两个时间点上的腋臭程度均显著降低（DEO1：24和48小时：P ≤0.0001；DEO3：24和48小时：P ≤0.0001）。而使用DEO2处理的腋窝仅在48小时显著降低（P=0.0001）。

图3. （A）使用DEO1 和DEO2 处理后24 和48 小时的腋臭减少程度。数据表示为平均值± 标准差。显著性差异标有星号[*P ＜ 0.05；n=28（24 小时）；n=34（48 小时）]。（B）使用DEO1 和DEO2 处
理的腋臭减少程度之间的差异（24 小时：Δ=0.5；48 小时：Δ=0.5，P ≤ 0.0001）

如图3A所示，评估人员在24和48小时后评估使用DEO1处理的腋臭程度（平均嗅觉评分：24小时：1.98±0.45；48小时：2.45±0.42）显著低于（24和48小时：P ≤ 0.0001）使用DEO2处理的腋窝（平均嗅觉评分：24小时：2.48±0.49；48 小时：2.95±0.46）。图3B 显示，使用DEO1和DEO2 处理24和48小时后的腋臭强度差异（24小时：Δ=0.5；48小时：Δ=0.5）保持不变。

然而，与DEO3相比，使用DEO1处理的腋窝在24和48小时后腋臭程度（平均嗅觉评分：24小时：1.30±0.47；48小时：2.17±0.60）没有显著差异（平均嗅觉评分：24小时：1.31±0.53；48小时：2.05±0.62）（图4）。

图4. 使用DEO1 和DEO3 处理24 和48 后腋臭减少程度。数据表示为平均值± 方差。显著性差异标有星号[*P ＜ 0.05；n=29（24 小时），n=31（48 小时）]

讨论

在人体腋窝中，好氧和厌氧生物的密度在5×105cm-2和1×106cm-2之间[7]。用肥皂和水清洗不能完全消除腋窝细菌。除了个人卫生的考虑外，西方国家许多人在日常生活中都使用香体液或止汗剂去除身体的难闻气味。目前大众喜好从止汗剂向香体液发展。比如从2014到2016年，德国女性消费者喜欢香体液数量高于止汗剂，香体液销量不断上升，而止汗剂销量不断减少[25]。

在香体液中，抗菌剂能够抑制细菌生长，因此常用于防止腋臭[19,20]。本研究的目的是确定一种新型高效并且皮肤体验舒适和耐受性良好的抗菌剂。为实现这一目标，我们专注于研究阳离子聚合物。

阳离子物质如带正电的季铵化合物可以与细菌的细胞膜结合。这个过程能引起细胞内成分外泄，蛋白质和核酸降解及细胞膜裂解[26,27]。因此，这些化合物有可能成为抗菌物质的候选物[27]。

一些聚合季铵化合物具有抗菌性能。如PQ-1 能诱导绿脓杆菌，粘质沙雷氏菌和金黄葡萄球菌的细胞质膜损伤及对白念珠菌的细胞膜损伤[28]。PQ-16 具有高正电荷，因此可能具有类似的化学反应模式。众所周知，聚合季铵化合物也是护发产品中的成分，如洗发露，护发素和造型产品[29]。它们的正电荷与头发中的离子结合，可作为成膜剂改善梳理效果和防止静电。

我们测试了不同聚合季铵化合物的抗菌活性（使用聚合季铵化合物处理后的细菌膜损伤）。结果表明PQ-16抗菌潜能最高。为确定PQ-16能否在标准使用条件下减少腋窝细菌数量，我们开发了含PQ-16的微乳液。在世界各地销售的香体液类型（滚珠、棒状和喷雾[30]）中，我们选择使用滚珠类进行研究。滚珠类香体液由于铺盖性最高，在腋窝没有油腻感，因此易于使用[30]。

我们开发的含PQ-16的新型配方皮肤相容性高，皮肤体验舒适，无刺激性的原因有两个：（i）基于PQ-16的结构和尺寸，它不会渗入皮肤[21]；（ii）微乳液不含乙醇。这些特性使得它适用于被剃须的皮肤而无灼烧感。

功效正常的香体液具有如下特征：（i）在一定的时间内具有抗菌的可靠效果；（ii）无毒、安全、皮肤体验良好[19]。

基于以上考虑，（i）我们的第一个研究目标是，比较含PQ-16的香体液与市场出售的具有24小时功效的香体液的抗菌效果。我们还进一步测试了相同配方的微乳液，但用10％ ACH替换掉PQ-16。

我们选择铝盐（最常用的止汗剂）ACH作为参考抗菌试剂。因为ACH可以通过阻塞外分泌腺导管来减少汗液的分泌，并且铝盐也具有抗菌功效[19,31]。

大多数香体液和止汗剂都使用香水和香料来掩盖身体的气味，使用户感觉清爽。由于目前市面出售的大部分香体液都含有香料，所以我们也使用了香水配方以进行对比研究。我们在体内菌群测定中确定了在使用香体液处理后不同时间点（基准时间和1，4，8，24和48小时后）腋下细菌减少的数量。实验设置中，我们测定DEO1与DEO2（组1）和DEO1与DEO3（组2）。结果表明，与DEO2相比，使用DEO1 处理（在所有时间点）log10细菌数量均显著降低。

通过本研究，我们证实了在使用新开发的含PQ-16的香体液24和48小时后，腋臭程度显著降低。数据证实，具有抗菌活性的PQ-16 在减少腋窝细菌数量方面非常有效。此外，新型含PQ-16的香体液与市场出售的宣称具有24小时除臭功效的香体液相比，使用24小时和48小时后腋臭程度相对较低。我们在研究中没有观察到与皮肤不相容的现象，因此表明此新型配方对于皮肤的体验是舒适并可靠的。

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