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发酵黑参对人体成纤维细胞的抗皱作用

来源:荣格 发布时间:2017-04-12 542
食品饮料及个护个人护理品原料配料其他 技术前沿应用及案例
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发酵黑参(Fermented Black Ginseng,FBG) 是由新鲜人参经过重复汽蒸和干燥加工后用酵母发酵而制成。众所周知,FBG具有抗氧化作用。而皮肤皱纹的形成与氧化应激和炎症反应相关。本研究的目的是使用人体成纤维细胞(HS68)确定FBG是否具有抗皱活性。根据韩国食品药品安全局(MFDS)对具有抗皱性化妆品的功效评价指南,我们试图阐明FBG对I型原胶原,基质金属蛋白酶MMP-1,MMP-2,MMP-9 和金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP-2)的影响。此外,我们还使用EpiOcular-EIT试剂盒检验了FBG是否对眼部具有刺激作用。研究结果表明,FBG 在浓度<10μg/ml时无细胞毒性,在高达100μg/ml 的浓度下对眼睛是安全的。在人体成纤维细胞中,FBG在0.3~10μg/ml 的浓度下可以显著(P<0.05)增强I 型原胶原的表达水平(从117.61±1.51 增加至129.95±4.47%)。与此相反,FBG 显著(P<0.05)降低MMP-1 的表达水平(从18.41±4.95降低至27.41±3.96%)。此外,FBG 在3μg/m


发酵黑参(Fermented Black Ginseng,FBG) 是由新鲜人参经过重复汽蒸和干燥加工后用酵母发酵而制成。众所周知,FBG具有抗氧化作用。而皮肤皱纹的形成与氧化应激和炎症反应相关。本研究的目的是使用人体成纤维细胞(HS68)确定FBG是否具有抗皱活性。根据韩国食品药品安全局(MFDS)对具有抗皱性化妆品的功效评价指南,我们试图阐明FBG对I型原胶原,基质金属蛋白酶MMP-1,MMP-2,MMP-9 和金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP-2)的影响。此外,我们还使用EpiOcular-EIT试剂盒检验了FBG是否对眼部具有刺激作用。研究结果表明,FBG 在浓度<10μg/ml时无细胞毒性,在高达100μg/ml 的浓度下对眼睛是安全的。在人体成纤维细胞中,FBG在0.3~10μg/ml 的浓度下可以显著(P<0.05)增强I 型原胶原的表达水平(从117.61±1.51 增加至129.95±4.47%)。与此相反,FBG 显著(P<0.05)降低MMP-1 的表达水平(从18.41±4.95降低至27.41±3.96%)。此外,FBG 在3μg/ml时可以将TIMP-2的表达水平增加至154.55%。然而,FBG 在10μg/ml 时使MMP-2和MMP-9的表达水平分别降低至45.15和66.65%。这些研究结果表明,作为化妆品中的有效成分,FBG具有潜在的抗皱效果。

引言

皮肤具有屏障功能,可以保护内脏免受周围环境中毒素的侵害。皮肤的基本结构分为三部分:表皮,真皮和皮下组织。表皮在最外层,主要由为形成细胞外基质(ECM)而分泌角蛋白和脂质的角质细胞,产生色素的黑色素细胞和呈递抗原的朗格汉斯细胞(1)组成。真皮在表皮下层,由结缔组织构成。它可以通过由胶原纤维,微原纤维和弹性纤维组成的ECM 为皮肤提供张力和弹性(2)。真皮下面的皮下组织由产生ECM 蛋白的成纤维细胞,消除病原体的巨噬细胞和保存体脂的脂肪细胞组成(3-8)。

皮肤老化的诱导过程十分复杂,包括内在因素(如遗传突变,细胞代谢和激素变化)和外在因素(如化学品,毒素,污染物和紫外线(UV)辐射)(5,9-11)。皮肤的衰老主要与ECM成分的萎缩相关,包括成纤维细胞数量减少,胶原蛋白和弹性蛋白表达水平降低,胶原纤维和弹性蛋白纤维解体(12-14)。皮肤老化的临床症状,如皱纹,下垂和松弛主要由胶原蛋白和弹性蛋白表达水平的变化引起(15)。表皮角化细胞和真皮成纤维细胞可以释放基质金属蛋白酶(MMP)。而老化或光损伤(UV 照射)的皮肤中,胶原蛋白和弹性蛋白的降解则与MMP 相关(10,14,17)。

在东亚国家,包括韩国,日本和中国,人参植物的根部可以用作传统草药。它具有增强身体机能,发挥神经保护作用,增强性功能和发挥抗癌作用的功效(18-22)。此外,研究者认为,人参的抗氧化和消炎作用与它对皮肤的抗老化作用相关(23,24)。人参中的药理活性成分包括多糖,聚乙炔和人参皂苷,其中人参皂苷被认为是最重要的成分(25)。到目前为止,研究者已在人参根部鉴定出约50 种人参皂苷。通过干燥和汽蒸过程,从人参中提取出来的这些天然人参皂苷可以转化为更稳定,更易于利用,更具生物活性的状态(26)。

未加工的生参通过简单的干燥过程可以加工成白参,或者为保持和改善其功效,通过汽蒸和干燥过程加工成红参(27)。黑参由生参经过多次重复汽蒸和干燥过程(9 次)后制成(28)。使用酿酒酵母发酵的黑参可以产生更具活性的人参皂苷(29,30)。发酵黑参(FBG)与白参和红参相比,生物活性成分和人参皂苷的含量比不同(31,32)。然而,FBG对皮肤的影响目前仍不清楚。因此,本次研究旨在确定FBG作为化妆品成分对皮肤的毒性和抗老化作用,为支持使用FBG 作为化妆品成分提供安全和有效性数据。

材料和方法

试剂


FBG从(Ginseng By Pharm Co., Ltd.,Wonju,Korea)获取。其详细组成信息如前人所述(26)。细胞生长所需的所有培养基均从(Gibco BRL Inc.,Franklin Lakes,NJ,USA)购买,如Dulbecco 改良的Eagle 培养基(DMEM)高葡萄糖,胎牛血清(FBS),青霉素链霉素和胰蛋白酶EDTA(0.25%)。3-[4,5 二甲基噻唑2 基]-2,5 二苯基四唑溴化物(MTT),视黄酸,Dulbeco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)从(Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA)购买。细胞裂解缓冲液,苯甲基磺酰氟(PMSF),MMP-9 抗体(sc-3852S),β肌动蛋白(sc-1616),辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG(7074)和抗鼠IgG从(Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA,USA)购买。聚偏二氟乙烯(PVDF)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)2 抗体(MAB 3310)从Millipore(Billerica,MA,USA)购买。所有其他试剂均为高质量试剂。

细胞培养

人体皮肤成纤维细胞(HS68)从美国标准培养物存储库(ATCC,Manassas,VA,USA)获取。在恒温37℃,5%CO2的潮湿环境中,细胞培养在10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM中。

细胞活力测定

如前所述(10),将HS68人体成纤维细胞以5×104个细胞每孔的密度接种在96孔板上,孵育48小时。48小时后,使用不同浓度的FBG(新鲜培养基中浓度分别为10、25、50、100和200μg/ml)或蒸馏水(DW:对照组)处理细胞,继续培养48小时。随后,向每个孔中加入200μl MTT(新鲜培养基中MTT 浓度为0.5mg/ml),然后在37℃恒温环境中孵育3小时。之后除去MTT 培养基,并向每个孔中加入200μl 二甲基亚砜。室温下反应10分钟,通过在PowerWave XS酶标仪(BioTek Instruments Inc.,Winooski,VT,USA)上测量570nm处的光密度来检测甲臜(显色剂)产量。然后将数据表示为以DW处理的对照组为基准的活细胞百分比。

眼刺激试验

研究使用眼部刺激试验(OCL-200-EIT;MatTek Corp.,Ashland,MA,USA)检验FBG 对眼部刺激的可能性。在恒温37℃,5%CO2 的环境中温育过夜后,用20μl 不含Ca++ 和Mg++的D-PBS(Sigma Aldrich) 预润湿OCL-200-EIT 30±2 分钟。预润湿后,将50μl FBG(10 和100μg/ml)局部涂于预润湿的OCL-200-EIT,并温育30±2 分钟。然后用300ml D-PBS 冲洗OCL-200-EIT 试剂盒中的组织,用5ml 新鲜培养基浸泡,并在37℃,5%CO2 下孵育2±0.4 小时。为了测量细胞活性,将OCL-200-EIT 与MTT 溶液(1μg/ml)温育3 小时。在提取异丙醇后,在PowerWave XS 酶标仪(BioTek Instruments Inc.)上测量570nm 处甲臜的吸光度。从2 个孔中计算每种测试物质的平均值。D-PBS 处理细胞用作对照。数据表示为以D-PBS 处理的对照组为基准的活性百分比。

I 型原胶原和MMP-1 水平的定量

本研究使用前胶原类I 型C 肽(PIP)EIA 试剂盒(Takara Bio Inc.,Otsu,Japan) 和人MMP-1 ELISA 试剂盒(Young In Frontier,Seoul,Korea) 对人体成纤维细胞中I 型原胶原和MMP-1 的表达水平进行定量。人体成纤维细胞以5×104 个细胞每孔的密度接种。48 小时后,细胞用DW(对照),不同浓度的FBG(0.3,1,3 和10μg/ml)或0.03μg/ml的视黄酸处理48小时。随后,依照制造商说明,使用I 型PIP EIA试剂盒和人类MMP-1 ELISA试剂盒测量培养基的I型原胶原和MMP-1表达水平。数据表示为以DW处理的对照组为基准的表达百分比。

MMP-2,MMP-9 和TIMP-2 水平的定量

本研究通过蛋白质印迹分析测量MMP-2,MMP-9 和TIMP-2 的表达水平。人体成纤维细胞用DW(对照),不同浓度的FBG(0.3,1,3 和10μg/ml)或0.03μg/ml 的视黄酸处理48 小时。为提取总蛋白,将处理过的细胞与含有1mM PMSF(Cell Signaling Technology Inc.)的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology Inc.)在冰上孵育5 分钟。孵育后,将全细胞裂解液短暂振荡,并在4℃下以12,000 rpm 转速离心20 分钟。上清液储存在-80℃。跑凝胶前,先通过Bradford 测定法测定蛋白质浓度,然后通过10%SDS-PAGE 分离全蛋白(25μg)。随后依照制造商说明使用转移装置(Bio Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA) 将分离蛋白转移到PVDF膜(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)。PVDF 膜在封闭缓冲液(含5%w/v 脱脂乳的TBST)中温育3 小时。初级抗体(MMP-1,1:1,000;MMP-9,1:500;TIMP-2,1:500)与转移膜在4℃下温育过夜。用TBST 清洗膜后,将转移膜与第二抗体(MMP-2 和MMP-9 的抗兔IgG,TIMP-2 的抗鼠IgG 1:1,000 稀释)在室温下温育2 小时(对MMP-2),或在4℃下温育过夜(对MMP-9和TIMP-2)。之后用TBST 清洗膜后,通过辣根过氧化物酶检测系统(Sigma Aldrich)检测蛋白质信号。数据表示为以DW处理的对照组为基准的表达百分比。

统计分析

本研究使用Microsoft Excel 计算表达值的平均值± 标准偏差。使用方差分析以及Prism 5.01(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)中的Bonferroni's 检验来评估FBG 处理前后蛋白质表达差异的统计显著性(P<0.05 或P<0.01)。

结果

FBG的体外毒性


本研究分别使用人体皮肤成纤维细胞(HS68)和眼部刺激试验(OCL-200-EIT)评价FBG对皮肤和眼睛的体外毒性。当HS68细胞分别用10,25,50,100和200μg/ml 的FBG 处理48小时后,细胞活性分别为96.17±6.36,93.68±5.64,94.64±4.66,90.31±4.97和88.01±3.87%。与对照组( 不使用FBG 处理)相比,仅有经10μg/ml的FBG 处理过的细胞在细胞活性方面没有表现出任何显著差异(P>0.05)(图1A)。EpiOcular-EIT结果表明,与对照组(PBS 处理)相比,10和100μg/ml 的FBG不会引起潜在的眼部刺激(图1B)。这些结果表明,浓度<10μg/ml的FBG不具有细胞毒性。与此同时,FBG在浓度高达100μg/ml时不会引起眼部刺激。

图1. (A)FBG 的细胞毒性。用DW 或FBG(10-200μg/ml)处理人体皮肤成纤维细胞(HS68)48 小时,并通过MTT 测定法测定细胞活性。数据是3 个单独试验的平均值± 标准偏差值。使用变量分析法将每个
数据与对照值进行比较,随后进行Bonferroni's 检验(**P<0.01)。(B)使用OCL-200-EIT 在不同浓度FBG(10μg/ml 和100μg/ml)下进行体外眼部刺激试验。D-PBS 为对照。FBG:发酵黑参;DW:蒸馏水;OCL-200-EIT:眼部刺激试验;D-PBS:Dulbeco's 磷酸盐缓冲盐水


FBG对胶原生成的影响

为检验FBG对皮肤中胶原合成的影响,本研究用无细胞毒性浓度的FBG处理成纤维细胞。研究结果显示,经过0.3,1,3 和10μg/ml的FBG处理过的细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,I 型前胶原产量显著(P<0.05)增加,分别增至117.61±1.51,122.62±2.69,128.07±5.76 和129.95±4.47%。阳性对照组,经0.03μg/ml的视黄酸处理过的细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,I型前胶原产量显著增加(P<0.05)至120.88±5.82%(图2)。

图2. FBG 对人体成纤维细胞中I 型原胶原的影响。用DW(Con:对照), MMP 表达水平的RA(0.03μg/ml 视黄酸)或FBG(10-200μg/ml)处理人体成纤维细胞48 小时,并使用Procollagen Type IC Peptide(PIP)EIA 试剂盒测量I 型原胶原的表达。数据是3 个单独试验的平均值± 标准偏差值。使用变量分析法将每个数据与对照值进行比较,随后进行Bonferroni's检验(**P<0.01)。FBG:发酵黑参;DW:蒸馏水

FBG对MMP的影响

随后,我们分析了经FBG 处理的HS68 成纤维细胞中与胶原降解相关的MMP表达水平。研究结果显示,经浓度为0.3,1,3和10μg/ml的FBG处理过的细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,MMP-1 表达水平显著(P<0.05)降低,分别降低至18.41±4.96,19.35±6.39,21.53±7.81 和27.41±3.96%。阳性对照组,经0.03μg/ml的视黄酸处理过的细胞与对照组(无FBG处理)细胞相比,MMP-1表达水平也显著(P<0.05)降低至37.78±7.71%(图3)。另外,经浓度为0.3,1,3 和10μg/ml 的FBG处理过的细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,MMP-2和MMP-9的表达水平分别为76.32,74.28,52.71 和45.15%以及106.66,100.00,90.53和66.65%。阳性对照组,经0.03μg/ml 的视黄酸处理过的细胞与对照组(无FBG处理)细胞相比,MMP-2和MMP-9的表达水平降低24.18%和41.07%(图4)。这些结果表明,MMP 的表达水平依赖FBG剂量而受其抑制。MMP 表达水平的降低可能与I型前胶原产量的增加相关。

图3. FBG 对MMP-1 在人体皮肤成纤维细胞中的影响。用DW(Con:对照),RA(0.03μg/ml 视黄酸)或FBG(0.3×10μg/ml)处理人体皮肤成纤维细胞48 小时。使用人MMP1-ELISA 试剂盒测量MMP-1 的
表达水平。数据是3 个单独试验的平均值± 标准偏差值。使用变量分析法将每个数据与对照值进行比较,随后进行Bonferroni's 检验(**P<0.01)。FBG:发酵黑参;DW:蒸馏水;MMP1:基质金属蛋白酶1


FBG 对TIMP-2的表达的影响

本研究在经FBG 处理过的HS68细胞中检查TIMP-2表达水平。经浓度为0.3,1,3和10μg/ml的FBG处理过的HS68细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,TIMP-2 的表达水平分别增加至122.66,137.45,154.55 和126.76%。阳性对照组,经0.03μg/ml的视黄酸处理过的细胞与对照组(无FBG 处理)细胞相比,TIMP-2的表达水平增加至143.06%(图5)。这些结果表明,FBG 可以增加TIMP-2的表达水平,从而引起对MMP 的抑制。

图4. FBG 对人体皮肤成纤维细胞中MMP-2 和MMP-9的影响。用DW(Con: 对照),RA(0.03μg/ml视黄酸) 或FBG(0.3×10μg/ml)处理人皮肤成纤维细胞48 小时, 并通过Western 印迹分析测量MMP-2
和MMP-9的表达,归一化为β 肌动蛋白的表达。FBG:发酵黑参;DW:蒸馏水;MMP:基质金属蛋白酶


讨论

人参皂苷是人参药理活性成分的主要部分(25)。根据化学结构,人参皂苷可以分为原人参二醇,原人参三醇和齐墩果皂苷(33)。前人研究报道,人参皂苷的20-O-b-d- 吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(化合物K)在体内具有抗转移,抗血管生成和抗过敏的活性(34,35)。具体来说,皮肤皱纹和干燥症可以通过局部施用化合物K 来改善。化合物K 能够在人体角质形成细胞中诱导透明质酸合酶2,以及增加老年无毛小鼠皮肤中的透明质酸含量(36)。此外,人体皮肤表面的皱纹可以通过I 型原胶原表达水平升高(37)的红参提取物来改善。总体来说,这些数据表明,局部施用人参提取物可以增强人体皮肤的抗皱效果。

FBG提取物经过更复杂的加工处理(重复汽蒸,干燥,并使用酿酒酵母发酵),与新鲜人参,白参和红参相比,可呈现不同的人参皂苷组成(38,39)。研究认为,这些差异能够增强其抗氧化和清除自由基的活性(29,40-42)。然而,FBG提取物的抗皱效果尚未在人体皮肤上研究。本次研究中,FBG提取物显著增加人体成纤维细胞中I型原胶原的表达水平。该结果表明,FBG提取物通过增加人体皮肤中的I 型原胶原表达水平而具有抗皱效果。

图5. FBG 对人体皮肤成纤维细胞中TIMP-2 的影响。用DW(Con :对照),RA(0.03μg/ml 视黄酸)或FBG(0.3μg/ml)处理人体皮肤成纤维细胞48 小时,并通过蛋白质印迹分析测量TIMP-2 的表达水平,
β 肌动蛋白的表达。FBG:发酵黑参;DW:蒸馏水;TIMP-2:金属蛋白酶2 的组织抑制剂


I型胶原蛋白是皮肤结缔组织中最丰富的蛋白质。它与其他类型的胶原蛋白(III,V 和VII),弹性蛋白,蛋白多糖,纤连蛋白和其他ECM 蛋白共同维持皮肤结构(43)。I型原胶原在人体真皮成纤维细胞中合成并分泌到真皮细胞外空间,并在其中进行蛋白水解。最后,I型胶原形成胶原束(纤维束),与其他ECM 蛋白共同维持皮肤的弹性(5,13)。原纤维(I型和III型)胶原可以减少老化和光损伤的皮肤(14,44,45)。I型胶原的降解与需要锌的内切蛋白酶家族MMP 密切相关,MMP 可以降解ECM 所有组分(46)。具体来说,MMP-1 诱发I 型和III 型纤维胶原的降解,而MMP-9进一步降解胶原酶产生的胶原片段(44)。MMP-2和MMP-9 可以共同作用切割弹性蛋白,IV 型胶原和几种ECM分子,而MMP-2 可以消化I,II和III型间质胶原(47)。前人研究表明,MMP-1 直接参与I 型前胶原的还原反应。MMP-2 和MMP-9 同时调节I 型前胶原的表达(47,48)。目前,所有已知的MMP 均被4 种同源TIMP 抑制(49)。其中,TIMP-2 通过直接抑制金属蛋白酶,包括MMP-2(50)抑制几种组织中的ECM 蛋白水解。也有研究认为,TIMP-2 通过与MMP-14 结合以激活MMP-2(50,51)。在本次研究中,FBG 提取物显著抑制人体成纤维细胞中MMP-1 的表达。MMP-2 和MMP-9 的表达水平依赖FBG 剂量而受其抑制。此外,经FBG 处理过的细胞中TIMP-2的表达总体呈现增加的趋势。总而言之,研究结果表明,FBG提取物可以通过抑制MMP-1,MMP-2 和MMP-9 从而诱导I 型原胶原的表达水平增加。FBG 对MMP 的抑制可能与FBG 引起TIMP-2 表达水平增加相关。

视黄酸可以有效的减弱皮肤光损伤的临床症状。它可以逆转皮肤老化后的不良反应(14,45,52)。视黄酸可以刺激人体成纤维细胞增殖,新生胶原合成以及过期或受损胶原的降解(53)。视黄酸的主要作用与抑制MMP有关(16,17)。此外,视黄酸可以引起人体支气管肺泡灌洗细胞中的MMP-9选择性下调以及TIMP-1的同时上调(54)。视黄酸还可以降低人体乳腺癌细胞中MMP-2的表达,这表明MMP-2 的抑制可能由上调的TIMP-2水平引起(55)。本次研究中,用视黄酸处理过的人体成纤维细胞与用FBG 处理过的细胞类似,这些细胞具有相似的I 型原胶原,MMP-1,MMP-2,MMP-9 和TIMP-2 的表达水平。这些结果表明,FBG对人体皮肤的抗皱作用机制可能和视黄酸的作用机制类似。

综上所述,我们的体外真皮试验研究表明,FBG处理过的细胞中I 型原胶原表达水平增加。此外,我们通过使用人体成纤维细胞和视觉组织评估了FBG的无毒性浓度。最后,我们证明FBG可以作为具有抗皱功效的安全的化妆品成分。

参考文献请见:DOI:10.3892/ijmm.2017.2858


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